EZH2對神經干細胞增殖的調控及其機制研究*

王 希，黃昌釗，高 峰，何 鵬，王銳英，高 燕

(1.桂林醫學院附屬醫院四肢創傷骨外科，廣西桂林 541001；2.桂林醫學院附屬醫院護理學院，廣西桂林 541001)

神經干細胞(neural stem cells,NSCs)是指存在于神經系統中，能分化為包括神經元細胞在內的多種細胞的一類細胞，能進行自我更新[1]。NSCs的發現和移植為解決脊髓損傷等疾病后神經元病理性減少及神經元間靶聯中斷提供了可能[2]。干細胞移植可通過減少二次級聯細胞的損傷，增強體內內源性神經干細胞的自我更新(即增殖)，從而補充功能受損的神經干細胞群[3]。因此，調控和提高NSCs的增殖至關重要。Zeste基因增強子同源物2(EZH2)是PcG基因家族的基因之一，能夠調控基因的表達，EZH2被發現能夠促進胚胎干細胞、腫瘤細胞的增殖和轉移[4]。并且EZH2在增殖的NSCs中高度表達[5]。但EZH2基因在NSCs增殖中的作用尚不清楚。本研究通過在人神經干細胞(hNSCs)中過表達和敲降EZH2基因的表達，來探究EZH2基因和NSCs增殖之間的聯系。

1 材料與方法

1.1材料 人神經元干細胞購自美國Sciencell公司。細胞培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司；引物、EZH2敲降慢病毒和過表達慢病毒及其各自對照慢病毒購自上海漢恒生物科技有限公司；CCK8細胞增殖檢測試劑盒和EdU檢測試劑盒購自海門市碧云天公司；細胞周期及凋亡流式檢測試劑盒購自日本東仁化學公司；胰蛋白酶、雙抗、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；EZH2、Cyclin D1、c-Myc鼠源單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG二抗購自美國Cell Signaling公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)鼠源單克隆抗體購自美國Proteintech公司；生物安全柜及細胞培養箱購自美國Thermo Fisher公司；倒置熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；酶標儀購自美國bio-tek EL公司；流式細胞檢測儀購自美國BD公司；凝膠電泳系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1神經干細胞的培養 應用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養基，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進行細胞培養，待細胞長至對數生長期時進行細胞傳代。

1.2.24種神經干細胞穩轉株構建 4種慢病毒(過表達對照慢病毒OV-Control，過表達慢病毒OV-EZH2；shRNA對照慢病毒sh-Control，shRNA干擾慢病毒sh-EZH2)轉染前18～24 h，將貼壁細胞鋪到細胞培養板中。待細胞貼壁且生長至50%左右融合度時用含有6 μg/mL polybrene的新鮮培養基替換原培養基，加入適量病毒懸液。37 ℃孵育。繼續培養24 h，用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。72 h后，加入2 μg/mL Puromycin，每隔2天重新換液加入藥物，持續觀察14 d左右，直至顯微鏡下觀察熒光細胞比例為100%(比例=GFP陽性細胞數/總細胞數)。隨后取一部分細胞用以收取蛋白和RNA，以檢測過表達和敲降效率。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測基因表達 每孔細胞加入TRIzol 1 mL。將樣品在室溫(15～30 ℃)放置5 min，使核酸蛋白復合物完全分離；每使用1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min；2～8 ℃，10 000×g離心15 min。樣品分為3層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%；把水相轉移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA；每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL異丙醇，室溫放置10 min；2～8 ℃，10 000×g離心10 min，移去上清液；用75%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol至少加1 mL 75%乙醇。2～8 ℃，7 500×g轉速以內，離心5 min，棄上清液；室溫放置干燥RNA沉淀，加入25～200 μL無RNase的水,用槍頭吸打幾次,55～60 ℃放置10 min使RNA溶解，-80 ℃保存。反轉錄反應程序：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，置于-20 ℃保存。將制備好的cDNA進行PCR擴增，擴增體系如下：SYBRGreen Mix 12.5 μL,上游引物(正向)0.5 μL，下游引物(反向)0.5 μL，雙蒸水(ddH2O) 9.5 μL，cDNA模板 2.0 μL，總體積 25.0 μL。反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，循環40次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s；數據采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。引物序列，正向：AAT CAG AGT ACA TGC GAC TGA GA；反向：GCT GTA TCC TTC GCT GTT TCC。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 細胞的培養、分組及處理同上。蛋白裂解液提取細胞總蛋白，用二辛酸硫酸銅(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。隨后進行蛋白定量和變性，應用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，120 V恒定電壓在分離膠中電泳60 min，在300 mA恒定電流下應用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜進行轉膜90 min，洗膜液(TBST)洗膜3遍后，使用5%牛奶封閉非特異性結合位點，封閉結束后，于4 ℃進行一抗(1∶1 000稀釋)中孵育過夜，TBST洗3遍之后，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗(1∶2 000稀釋)室溫中孵育2 h，TBST洗膜后，加入化學發光劑(ECL)反應并利用化學發光成像儀檢測。

1.2.5CCK8檢測細胞增殖 細胞培養于6孔板，按照基因干擾陰性對照組(sh-Control)、基因干擾組(sh-EZH2)、基因過表達對照組(OV-Control)、基因過表達組(OV-EZH2)分別對細胞進行對應慢病毒轉染，慢病毒轉染24 h后，直接配置含10% CCK8的培養基，以換液的形式加入。37 ℃孵育0.5 h，將孵育后的上清液轉移至96孔板，酶標儀測定450 nm處吸光度；Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)潤洗細胞3次，加入培養基繼續培養至48、96 h，重復上述實驗內容，繪制細胞生長曲線。

1.2.6EdU摻入法檢測細胞增殖 用細胞培養基稀釋EdU溶液(培養基:試劑A=1 000∶1)，制備適量50 μmol/L的Edu培養基；每孔加入100 μL 50 μmol/L EdU培養基孵育1 h，棄培養基；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次，每次5 min；每孔加入100 μL 4%多聚甲醛細胞固定液，室溫孵育30 min；每孔加入2 mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5 min后，棄甘氨酸溶液；每孔加入100 μL PBS，脫色搖床清洗5 min，棄PBS；每孔加入100 μL滲透劑(0.5% Triton X-100的PBS)脫色搖床孵育10 min；PBS清洗1次，5 min;每孔加入100 μL的1 mg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，避光、室溫、脫色搖床孵育10 min，棄染色反應液；每孔每次加入100 μL PBS清洗1～3次；染色完成后，熒光顯微鏡拍照。

1.2.7流式檢測細胞周期和凋亡 細胞接種于6孔板，按照基因敲降陰性對照組(sh-Control)、基因敲降組(sh-EZH2)、基因過表達對照組(OV-Control)、基因過表達組(OV-EZH2)4組細胞培養48 h后，0.25%胰酶消化收集細胞，并用1 mL PBS清洗剩余細胞1次，全部加入15 mL管中。800 r/min離心5 min，去除上清液，加5 mL PBS重懸細胞，再次離心棄上清液，重復2次，最后重懸細胞于0.1 mL PBS中，并轉移到1.5 mL離心管中。對于細胞周期檢測，按照1∶100加入碘化丙啶(PI)染液，置于垂直混合液上室溫孵育1 h。對于細胞凋亡檢測，每樣品中分別加入5 μL PI染液和5 μL磷脂結合蛋白(Annexin-V-FITC)染液，置于垂直混合液上室溫孵育30 min，1 500 r/min離心5 min，去除上清液，加1 mL PBS重懸細胞，再次800×g離心5 min，棄上清液，重復3次，最后將洗好的細胞重懸于0.2 mL PBS中。用錫箔紙包住避光，將細胞加入流式管中，在BD流式細胞儀上分析。

2 結 果

2.1過表達和敲降穩轉株的構建及鑒定 4種慢病毒轉染NSCs后，利用嘌呤霉素進行藥物篩選，14 d后，細胞GFP陽性率達到100%(圖1A)。同時，實驗結果顯示，相較于OV-Control組，OV-EZH2 mRNA EZH2的表達水平上調400%以上，且差異有統計學意義(P<0.05，圖1B),相較于sh-Control組，sh-EZH2組EZH2 mRNA表達水平下調至30%以下，且差異有統計學意義(P<0.05，圖1B)。Western blot得到一致的實驗結果(圖1C)。

A：細胞GFP熒光顯微鏡拍照(×40)；B：EZH2基因mRNA表達水平鑒定(n=4)；C：EZH2基因蛋白表達水平鑒定；a：P<0.05，與OV-Control組比較，b：P<0.05，與sh-Control組比較

圖1EZH2基因過表達和敲降細胞穩轉構建鑒定

A：過表達和敲降細胞EZH2基因，CCK8檢測細胞活力(n=4)； B：試劑盒檢測神經干細胞中EdU陽性率，激光共聚焦拍照(×40)；C：神經干細胞中EdU陽性率統計圖(n=4)；a：P<0.05，與OV-Control組比較，b：P<0.05，與sh-Control組比較

圖2敲降或過表達EZH2對神經干細胞增殖的影響

2.2過表達或敲降EZH2對NSCs增殖的影響 實驗結果顯示，對比OV-Control組，OV-EZH2組24、48、72 h時細胞增殖活力上調，差異有統計學意義(P<0.05，圖2A)。OV-EZH2組EdU陽性率(69.21±9.86)%高于OV-Control組(37.00±2.70)%，差異有統計學意義(P<0.05，圖2B、C)。相較于sh-Control組，sh-EZH2組24、48、72 h時細胞增殖活力顯著下調(P<0.05，圖2A)，且sh-EZH2組細胞EdU陽性率(16.83±5.53)%比sh-Control組(43.52±5.99)%顯著下調(P<0.05，圖2B、C)。

2.3過表EZH2或干擾EZH2表達對NSCs細胞周期的影響 實驗結果顯示，相較于基因敲降陰性對照組(sh-Control)，EZH2干擾(sh-EZH2)組細胞處于G1期細胞比例顯著上調(圖3、表1，P<0.05)，而S期和G2期細胞比例顯著降低(圖3、表1，P<0.05)。反過來，研究中利用慢病毒對EZH2基因進行過表達，相較于對照組(OV-Control)，在NSCs中EZH2過表達后(OV-EZH2)，G1期細胞比例顯著下降(圖3、表1，P<0.05)，而S期和G2期細胞比例顯著上升(圖3、表1，P<0.05)。

2.4體外過表達EZH2或沉默EZH2表達對NSCs凋亡的影響 研究結果顯示，EZH2干擾組和EZH2過表達組與其各自對照組相比，OV-Control組凋亡率為(5.97±0.15)%，OV-EZH2組凋亡率為(5.71±0.27)%，兩者之間差異無統計學意義(P>0.05)；sh-Control組凋亡率為(5.74±0.19)%，sh-EZH2組凋亡率為(5.41±0.31)%，且兩組間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

表1 過表EZH2或干擾EZH2表達對神經干細胞細胞周期的影響

a：P<0.05，與OV-Control組比較；b：P<0.05，與sh-Control組比較

圖3 過表EZH2或干擾EZH2表達對NSCs細胞周期的影響

圖4 體外過表達EZH2或沉默EZH2表達對NSCs凋亡的影響

2.5在NSCs中過表達EZH2能上調CyclinD1和c-Myc蛋白表達 通過Western blot發現，過表達EZH2基因(P<0.05)之后，Cyclin D1和c-Myc蛋白的表達水平也隨之上調，且差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

A：Western blot實驗代表圖；B：Western blot條帶灰度統計分析圖；a：P<0.05，與OV-Control組比較；n=4

圖5EZH2基因過表達對CyclinD1和c-Myc蛋白表達水平的影響

3 討 論

NSCs移植是臨床上將NSCs移植到宿主體內，使NSCs向相關病變部位聚集并增殖存活，進而分化為神經功能細胞，達到神經系統疾病治療目的的方法。近年來，NSCs研究成為治療諸如脊髓損傷等神經系統疾病的熱點手段[6]。但是，胚胎性NSCs可自動發生分化，具有無限增殖能力，移植至患者體內有致瘤的可能[7]。另外移植的環境可能與NSCs原本的生存條件不同，不利于NSCs的存活及分化[8]。因此如何控制NSCs的增殖，既能保證移植細胞的存活率和自我更新能力，又能控制其增殖速度和分化時間節點，是目前該治療手段亟待解決的問題。因而本研究采取慢病毒手段，在NSCs中穩定過表達和敲降EZH2基因的表達，對其在NSCs增殖中的作用及其機制進行研究，意圖尋找到調控NSCs移植中控制細胞增殖和分化的鑰匙。

EZH2作為PCR2的催化亞基，能抑制轉錄，進而影響到下游重要的信號通路，在染色體水平調節基因活性，在干細胞的更新與維持中發揮重要作用[9-10]。有研究觀察到，NSCs向不同方向增殖分化時，EZH2表達水平存在明顯差異[11-12]：增殖的NSCs中高度表達，在NSCs向神經元細胞分化時，EZH2表達水平降低，在NSCs向星形膠質細胞分化時，EZH2表達完全停止，在NSCs向少突膠質細胞分化過程中，從少突膠質前體細胞分化到不成熟少突膠質細胞期間，EZH2維持高水平表達[13]。在本研究中，成功過表達和干擾EZH2基因的表達之后，分別能夠促進和抑制NSCs的增殖，影響細胞進入細胞周期的速度，而對細胞凋亡水平并未見顯著影響；因而設法調節移植NSCs中EZH2基因的表達可以起到調控NSCs增殖的作用。另外，進一步的研究還發現，過表達EZH2基因，能夠促進增殖相關蛋白Cyclin D1和c-Myc的表達，這可能是其調控細胞增殖潛在的分子機制，而具體的信號途徑還需要進一步的分析和研究。

本實驗結果表明，EZH2能夠在體外調控NSCs的增殖，為臨床細胞學治療脊髓損傷及相關疾病提供了實驗依據。