基于牛蒡根的靈芝固體發酵菌質化學成分的初步分析*

張命龍 ，楊秋玲 ，闞慧建 ，王志宏 ，陳智勇 ，彭密軍 **

（1.廣東省測試分析研究所廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；2.廣東中測食品化妝品安全評價中心有限公司，廣東 中山 528437；3.中山業成生物科技有限公司，廣東 中山 528437）

靈芝（Ganoderma lingzhiS.H.Wu et al.）為名貴大型真菌之一，具有較高的食用和藥用價值[1］。目前靈芝多糖和三萜類化合物成分被公認為靈芝中主要的藥理活性成分[2-3］。靈芝在臨床應用上也表現出良好的療效[4］。最近藥理研究顯示靈芝三萜類化合物成分可延緩遺傳性多囊腎?。ˋDPKD） 的發展[5］；靈芝孢子油具有保護心臟的功能，可作為潛在的心臟病保護劑[6］。

牛蒡（Arctium lappaL.）屬菊科（Asteraceae）植物，全株均可入藥。牛蒡根（burdock root）系牛蒡的主要用藥部位，是一種天然的食藥兼用資源，富含多糖、膳食纖維、黃酮、蛋白質、氨基酸等[7-9］。近年來連續有關于牛蒡根藥理活性新的報道。研究發現牛蒡根具有降血糖[10-11］、抗炎癥[12］、改善脂質代謝等作用[13］。

藥用真菌的固體發酵是現代生物工程技術的重要領域。莊毅[14］指出藥用真菌雙向型固體發酵是一個新的起點，其區別于傳統的固體發酵中營養基質單向為真菌提高碳氮源等營養成分。雙向固體發酵以中藥材為基質，真菌菌絲體從中吸收營養，同時又改變藥性成分，具有雙向性，可實現中藥材的二次開發，對原中藥材起到“增效”、“擴用”、“減毒”效果，具有顯著優勢[15］。靈芝作為木腐真菌，菌絲體活力高，分解能力強。牛蒡根經靈芝菌絲體發酵后，菌質化學成分較原藥材的變化情況尚不明晰。故本研究對牛蒡根經靈芝固體發酵的藥性菌質化學成分進行初步分析，以期為開發這一新型發酵產物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

牛蒡根和牛蒡根靈芝發酵菌質，由中山業成生物科技有限公司提供。將牛蒡根切成小段，烘干，加水浸潤，攪拌均勻，裝入栽培袋中，蓋上棉塞包扎，于121℃滅菌50 min。冷卻后，在無菌條件接入靈芝菌種，于24℃～28℃避光培養，待發酵至菌絲滿袋后，取出，于60℃～70℃烘干后粉碎即得牛蒡根靈芝菌質。

1.2 主要試劑和儀器

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、乙醇等試劑均為國產分析純，甲醇為色譜級，美國Merck公司；靈芝酸B，上海同田公司，純度98%；胞苷，加拿大Trc公司，純度98%；尿苷，加拿大Trc公司，純度98%；鳥苷，中國食品藥品檢定研究院，純度93.6%；腺苷，美國Sigma公司，純度99.8%；蘆丁，中國食品藥品檢定研究院，純度98%；綠原酸，上海阿拉丁生化公司，純度98%。

AS20500BT超聲波儀，天津奧特賽恩斯公司；UV2700紫外可見分光光度計，日本島津公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；N310全自動定氮儀，廣州格丹納公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量檢測

采用苯酚-硫酸法[16］進行測定。

（1） 標準曲線制作

精密稱取葡萄糖（105℃下干燥2 h） 49.95 mg于500 mL容量瓶中，加純水至滿刻度后搖勻。分別吸取 0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL對照品品溶液于比色管中，補水至1.0 mL，加入5%苯酚0.5 mL和濃硫酸2.5 mL，充分搖勻。室溫放置20 min后于分光光度計488 nm處測定吸光值，以1.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白，以葡萄糖含量（μg·mL-1）為橫坐標，吸光值為縱坐標制作標準曲線，得回歸方程Y=0.014 0X-0.038 0，R2=0.999 7。

（2） 樣品測試

精密稱取粉碎后均勻樣品1 g于具塞試管中，加25 mL純水，搖勻，采用沸水浴提取2 h，冷卻后過濾，在殘渣中加20 mL純水再提取1 h，過濾合并2次濾液，殘渣用少量水洗滌2次，洗滌液并入容量瓶中，定容至50 mL，充分搖勻。取1 mL提取液加入4倍體積無水乙醇，混勻，4℃靜置過夜。次日離心棄上清，沉淀物用80%乙醇洗滌數次后，溶解待測。吸取樣液1 mL，按照上述標曲步驟操作測定吸光值，代入回歸方程中計算樣品多糖含量。

1.3.2 總三萜酸含量檢測

參考文獻 [17］方法進行測定。

（1） 標準曲線制作

精密稱取靈芝酸B對照品，用無水乙醇溶解，配制成 511.6 μg·mL-1的對照品溶液。分別吸取 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.5 mL 對照品溶液，加入濃度為50%的濃硫酸乙醇溶液2 mL，以溶劑做空白，沸水浴5 min，取出用流水速冷，30 min內于分光光度計526 nm處測定吸光值。以對照品質量（μg）為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線，得回歸方程Y=0.000 7X-0.038 7，R2=0.998 1。

（2） 樣品測試

稱取2 g樣品，加入無水乙醇，參照文獻 [17］中規定的方法制備供試樣品。按上述制作標準曲線方法進行樣品顯色，測定526 nm處吸光值，代入回歸方程中計算樣品中總三萜酸含量。

1.3.3 總黃酮含量檢測

（1） 標準曲線制作

參考文獻 [18］方法制作標準曲線。精密稱取蘆丁6.00 mg于容量瓶，加甲醇定容至10 mL，配制成約600 μg·mL-1的對照品溶液。吸取不同體積的對照溶液于比色管中，加入30%乙醇溶液定容至5 mL，再加入0.3 mL濃度為5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻后放置5 min，加入0.3 mL濃度為10%的硝酸鋁溶液，搖勻后靜置1 h，最后加入4 mL1.0 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，用30%乙醇溶液定容至10 mL，以溶劑為空白。于510 nm波長下測定吸光值，按對照品質量（μg）與吸光值的關系，制作標準曲線，得回歸方程Y=0.001 33X＋0.004 75，R2=0.999 9。

（2） 樣品測試

參考文獻 [19］，取2 g樣品，加入濃度為42.2%的乙醇溶液，按液料比40∶1，于82℃、浸提3.5 h的條件提取1次，冷卻定容至100 mL。取適量樣液離心后按制作標準曲線方法進行樣品顯色，代入回歸方程中計算總黃酮含量。

1.3.4 核苷含量檢測

參考文獻 [20］方法進行測定。

（1） 色譜條件

色譜柱為 Aglient TC-C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相為水-甲醇:0～20 min，甲醇5%；35 min，甲醇20%；36 min，甲醇5%；40 min，甲醇5%。流速:1.0 mL·min-1，進樣量 10 μL，紫外檢測器，波長259 nm，柱溫30℃。

（2） 標準曲線制作

分別精密稱量5.00 mg左右的4種核苷對照品，置于25 mL容量瓶中，加純水溶解并定容，制成約200 μg·mL-1的核苷混合標準品母液。配制6個不同濃度的混合標準品工作液，按上述色譜條件測試。通過單個核苷對照品確定各自色譜峰保留時間，以核苷標準品濃度對相應峰面積繪制標準曲線，得回歸方程（表4）。

（3）樣品制備和分析

精密稱取各樣品0.5 g，置于10 mL具塞試管中，加入10 mL純水，密塞?；靹蚝螅暎?00 W，40 kHz）提取1 h。取出試管冷卻至室溫，搖勻后取適量提取液4 000 r·min-1離心10 min。上清液過0.45 μm微孔濾膜，轉移至進樣瓶中，按給定色譜條件進行HPLC分析。

1.3.5 蛋白質含量檢測

蛋白質含量的測定參照GB 5009.5-2016食品安全國家標準食品中蛋白質進行測定（凱氏定氮法）[21］。

1.3.6 HPLC 指紋圖譜

參照參考文獻 [22］進行HPLC指紋圖譜分析。精密稱取適量綠原酸對照品，用甲醇配置成105.2 μg·mL-1的對照品溶液。色譜條件:Aglient TC-C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 0.04%磷酸溶液-甲醇:0，甲醇15%；30 min，甲醇38%；60 min，甲醇 38%。流速 1.0 mL·min-1，進樣量 10 μL，紫外檢測器，波長320 nm，柱溫30℃。稱取1 g樣品加入甲醇超聲（500 W，40 kHz） 提取1 h，減壓蒸干，用甲醇溶解定容10 mL。過濾后，上機分析。將色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版）”[23］進行處理。

1.4 數據分析

試驗數據以平均值±標準誤表示。用統計分析軟件SPSS 19.0對數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 多糖含量

牛蒡根和牛蒡根靈芝發酵菌質中多糖含量的檢測結果見表1。

表1 牛蒡根和牛蒡根發酵菌質中多糖含量Tab.1 Content of polysaccharides in burdock root and burdock root fermentation fungal substance（n=3）

由表1可知，發酵前，牛蒡根中多糖含量為9.94%，經靈芝菌絲發酵后多糖降至 2.76%（P＜0.01），大幅降低72.2%。由此推測，靈芝菌絲體在生長過程中，大量分解利用了牛蒡根中的多糖成分，為生命活動提供能量。這提示靈芝除可直接利用葡萄糖、蔗糖、淀粉外源性的碳源外，還可利用植物材料中的多糖碳源物質，實現菌絲體生長和生物轉化。

2.2 總三萜酸含量

牛蒡根和牛蒡根靈芝發酵菌質中總三萜酸含量的檢測結果見表2。

三萜酸是靈芝三萜類化合物中主要藥效成分[24］。由表2可知，發酵前，牛蒡根中未檢出三萜酸。發酵后，牛蒡根靈芝菌質中出現了三萜酸，含量達到0.14 mg·g-1。于華崢等[25］運用 HPLC 法測定靈芝子實體、菌絲體和孢子粉中多種靈芝三萜類成分，結果顯示靈芝菌絲體中也含有靈芝三萜酸，主要為靈芝酸S和靈芝酸T，兩者之和為0.74 mg·g-1，但未檢出靈芝酸A和靈芝酸B。對于牛蒡根靈芝發酵菌質具體為何種靈芝三萜酸成分還需分離鑒定。

表2 牛蒡根和牛蒡根發酵菌質中總三萜酸含量Tab.2 Content of triterpenic acids in burdock root and burdock root fermentation fungal substance（n=3）

2.3 總黃酮含量

牛蒡根和牛蒡根靈芝發酵菌質中總黃酮含量的檢測結果見表3。

表3 牛蒡根和牛蒡根發酵菌質中總黃酮含量Tab.3 Content of total flavonoids in burdock root and burdock root fermentation fungal substance（n=3）

由表3可知，發酵前，牛蒡根總黃酮含量為3.47%。除多糖外，黃酮類化合物也是牛蒡根主要活性成分，如槲皮素、山奈酚、木犀草素[26］。發酵后，牛蒡根靈芝發酵菌質中總黃酮含量降低至0.34%（P＜0.01）。這說明，靈芝菌絲吸收牛蒡根的營養成分生長時，同時也顯著降低牛蒡根中的黃酮類成分含量。

2.4 核苷含量

牛蒡根和牛蒡根靈芝發酵菌質中核苷含量的檢測結果見表4、表5和圖1。

表4為核苷混合標準品的線性方程。圖1為標準品和測試樣品的色譜圖。由圖1可知，樣品中4種核苷的色譜峰與雜質峰分離效果較好，保留時間適中。表5為樣品中4種核苷的含量。發酵前，牛蒡根中未檢出腺苷，3 種核苷總量為 861.05 μg·g-1；發酵后，牛蒡根靈芝發酵菌質中同時含有4種核苷，其中胞苷 （cytidine） 含量降低 （P＜0.01）、尿苷（uridine） 和鳥苷 （guanosine） 含量增加 （P＜0.01），腺苷 （adenosine） 含量為 208.80 μg·g-1，核苷總量增加至 1 113.49 μg·g-1（P＜0.01）。王金艷等[20］全面分析了龍泉、黃山等4個產地靈芝孢子粉多種核苷含量，發現黃山靈芝孢子粉中此4種核苷含量最豐富，總量為 715.62 μg·g-1。可見，牛蒡根靈芝發酵菌質4種核苷的含量遠高于靈芝孢子粉。

表4 4種核苷的線性回歸方程Tab.4 Linear regression equation of four nucleosides

表5 牛蒡根和牛蒡根發酵菌質中三萜含量Tab.5 Content of nucleosides in burdock root and burdock root fermentation fungal substance（n=3）

同時由圖1的色譜圖可知，10 min～15 min出現多個色譜峰，說明相對牛蒡根，牛蒡根靈芝發酵菌質中產生了新的成分。在28 min左右牛蒡根靈芝發酵菌質的色譜峰較牛蒡根色譜峰高度顯著降低，說明該成分的含量大幅降低。結果表明，靈芝菌絲體發酵使牛蒡根的水溶性成分出現有增有減的變化。其原因可能是靈芝菌絲體的生理代謝活動產生多種酶，通過生物催化導致這些成分出現變化。

圖1 混合對照品與樣品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixture standards and samples

2.5 蛋白質含量

牛蒡根和牛蒡根靈芝發酵菌質中蛋白質含量結果見表6。

由表6可知，牛蒡根經靈芝菌絲體發酵后，蛋白質含量提高了 29.14% （P＜0.01）。雖然菌絲生長需要消耗氮源，會利用牛蒡根中的蛋白質，但可能因自身合成代謝強于分解代謝，導致發酵后菌質中的蛋白質含量增加。這表明靈芝菌絲體可通過發酵實現植物蛋白質的轉化。

表6 牛蒡根和牛蒡根發酵菌質中蛋白質含量Tab.6 Content of protein in burdock root and burdock root fermentation fungal substance（n=3）

2.6 HPLC指紋圖譜比較

以綠原酸為對照品，牛蒡根和牛蒡根靈芝發酵菌質的HPLC指紋圖譜如圖2所示。

由圖2可以看出，發酵前，牛蒡根醇提液的色譜峰（S2）較多，并且含有綠原酸色譜峰。發酵后，在色譜圖前10 min，牛蒡根發酵靈芝菌質（S3） 和牛蒡根的峰相似度較高；而在第10分鐘后，牛蒡根靈芝發酵菌質的圖譜中幾乎沒有明顯的色譜峰，并且不再有綠原酸色譜峰。由此可知，牛蒡根在發酵前后的HPLC指紋圖譜相似度很低。結果表明，靈芝菌絲體發酵明顯改變了牛蒡根的某些化學成分，可能被分解或被結構修飾、轉化。

圖2 HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint

3 討論

綜合運用分光光度法、HPLC法、凱氏定氮法對牛蒡根經靈芝菌絲體發酵前后多種成分進行了較為全面的對比分析。發酵后其多糖和黃酮含量顯著降低，核苷含量顯著升高，并新產生腺苷和三萜酸類物質；蛋白質含量顯著升高。HPLC指紋圖譜顯示發酵前后成分相差較大。結果表明牛蒡根經靈芝菌絲體發酵后原藥材的成分發生了較大變化，體現了真菌發酵中藥材的雙向效果。何斌[27］發現丹參經靈芝雙向發酵后的藥性菌質在活血化瘀和增強免疫方面的藥效優于丹參原藥材，這說明靈芝發酵起到了“增效”作用。此外靈芝雙向發酵鉤吻根后，菌質有毒生物堿化合物含量降低，毒性降低，藥效穩定，起到“減毒存效”作用[28］。對于牛蒡根靈芝發酵菌質相對牛蒡根原藥材是否具有“增效、擴用”的優勢，本課題組將適時開展相關藥理藥效實驗予以驗證。

牛蒡苷元是牛蒡子的主要活性成分，而牛蒡根中通常不含牛蒡苷元或含量極低[29］，筆者嘗試去檢測發酵前后的樣品，均未檢測到牛蒡苷元。這表明靈芝菌絲體在發酵過程中不能產生牛蒡苷元。同時采用HPLC法檢測牛蒡根靈芝發酵菌質中靈芝酸A、靈芝酸B的含量，也未檢出。目前被發現的靈芝三萜類化合物已超過160種[3］，至于牛蒡根靈芝發酵菌質中是否存在新型三萜類化合物還有待后續分離鑒定。

目前藥用真菌發酵菌質在醫藥領域已有應用?；倍|就是槐耳菌（Trametes robinioplilaMur.）在玉米、麥麩等營養基質上經培養后所得的干燥菌質（即藥用菌質），已被批準為國家中藥一類新藥，具有扶正固本、活血消癥的功效?；倍謩e在營養基質與藥性基質上發酵產生藥用與藥性兩種菌質，通過對其藥效比較，證實藥性菌質出現了“增效、擴用”的理想結果[16］。今后隨著真菌雙向固體發酵研究的深入及其應用不斷發展，可能會出現更多通過發酵中藥材制得藥性菌質的真菌。因此，靈芝的應用范圍將由子實體、孢子粉、菌絲體拓展到通過與中藥材組合進行雙向發酵的菌質原料，具有重要的實踐意義和應用價值。在此過程中闡明了發酵過程的生物轉化機制，明確了活性物質和活性之間的構效關系，可為更好地合理利用靈芝雙向發酵菌質資源提供理論依據。