山西境內一種野生雙孢蘑菇菌株特異性鑒定*

張紅剛，郭明慧**，郭 尚，梁枝榮

（1.山西省農業科學院食用菌研究所，山西 太原 030000；2.忻州市沐野食用菌研究所，山西 忻州 034000）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 在分類上屬于真菌門（Eumycophyta） 擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 蘑菇屬（Agaricus）。雙孢蘑菇是世界上可人工栽培的食用菌中栽培最廣泛、栽培量最大和消費最多的品種[1］。近年來我國雙孢蘑菇產業發展迅速，生產量在栽培食用菌中居第2位，是我國出口創匯的主要食用菌之一。目前我國栽培的自主品種為As2796、W2000等品種，其他為國外引進品種。

現階段雙孢蘑菇選育所面臨的主要問題是野生雙孢蘑菇種質資源匱乏，中國保存的栽培種質遺傳背景狹窄，野生種質的收集、評價與創新利用研究力度不夠，尚未選育出可替代As2796的新品種[2］。因此我國特有的雙孢蘑菇野生資源收集和種質資源創制具有重大意義。據統計，我國具有較為豐富的蘑菇屬種質資源，現階段世界上已報道蘑菇屬200余種，其中我國已記錄43個種，2個變種。野生雙孢蘑菇分為白色和棕色2種[3］。有文獻報道在我國的西藏曾采集到白色野生雙孢蘑菇，并進行了相關出菇試驗[4］，但有關棕色雙孢蘑菇的報道較少見到。

沐野1號菌株于2008年8月17日從五臺山草地采集分離，該品種與現已審定的雙孢菇品種不同之處在于:一是外形不同，沐野1號呈棕褐色，菇柄較長；二是口感獨特，菇柄、菇蓋嫩脆香，味道厚濃；三是在同等條件下，其出菇早，產量較高；四是該菌株便于栽培管理，秸稈畜禽糞便粗制發酵栽培即可，且其菌絲生長快、活力強，易于粗放管理；五是易于加工，便于保存，經曬干、烘干后味道濃香。沐野1號作為雙孢蘑菇野生品種，具有廣闊的市場前景。因此鑒定出該野生雙孢蘑菇的品系，對于雙孢蘑菇育種具有重要意義。本研究采用形態學和ISSR法，對該菌株進行了特異性分析研究。

1 材料與方法

1.1 野生資源采集與形態學分析

2008年8月17日在山西省五臺縣五臺山高原草地采集到野生蘑菇樣品，并分離培養出菌種，制作標本。對照品種由農業部微生物產品質量監督檢驗測試中心（武漢）提供。形態學分析是以新鮮標本為材料，對其進行形態特征觀察[5-7］。

1.2 分子標記分析

1.2.1 DNA 提取

DNA提取樣品，是將子實體分離，進行PDA培養，然后利用PD液體培養基培養菌絲體；DNA的提取方法采用CTAB法。

1.2.2 ITS-RFLP 分析

試驗引物序列，由擎科生物技術有限公司合成，見表1，采用參考文獻中的方法進行測定[8-11］。

表1 菌種鑒定所用ISSR引物Tab.1 ISSR primers for strain identification

將待檢菌株菌絲體活化、培養，進行基因組DNA提取及質量檢測，PCR擴增及電泳檢測均按照中華人民共和國農業行業標準操作[8］。

（續表 1）

1.2.3 同源性分析

利用DNAMAM軟件對野生蘑菇沐野1號菌株和雙孢蘑菇已認定品種As4607、As2796、英秀一號、棕秀一號、蘑菇176、棕蘑1號和蘑加1號，以及山西省境內發現的菌株晉陽1號的ITS4和ITS5序列進行同源性比對，菌株編號見表2。

表2 對比菌株編號Tab.2 Number of comparative strains

2 結果與分析

2.1 菌株沐野1號的形態特征

菌株沐野1號的形態特征見圖1。

圖1 子實體及菌絲體形態Fig.1 Fruiting body and mycelium morphology

沐野1號菌株子實體（如圖1所示） 為中等大小。菌蓋直徑3.3 cm～3.7 cm，初期呈半球形，成熟后近平展，表面為污白色，具有褐色纖毛狀鱗片，菌蓋中央鱗片密，邊緣稍稀疏，菌蓋邊緣光滑，成熟后稍內卷。菌肉呈白色，厚度為0.8 cm～1 cm。菌褶離生，較密，不等長，成熟或干后呈黑褐色。菌柄長 4.5 cm～7.5 cm，粗 0.6 cm～1.2 cm，圓柱形，基部膨大，實心，表面平滑或有白色的短細小纖毛。孢子橢圓形至卵圓形， （4.6～6.3） μm× （6.3～8.7）μm，擔子雙孢，緣囊體多，尺寸為 （6.9～9.6） μm×（21.1～33.8） μm。

2.2 雙孢蘑菇菌株的ISSR指紋圖譜

雙孢蘑菇菌株的ISSR指紋圖譜見圖2～圖10。

圖2 引物H3、H4、H5對雙孢蘑菇菌株擴增的ISSR指紋圖譜（從左到右）Fig.2 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H3,H4 and H5(from left to right)

由圖2～圖10可以看出，利用49條引物對2個待檢雙孢蘑菇菌種進行了ISSR擴增，從中選取能夠擴增出穩定特異條帶的25條引物，分別為H3、H4、H5、H6、H8、H9、H12、H13、H14、H15、H16、H18、 H19、 H20、 H21、 H22、 H25、 H26、 H28、H33、P4、P19、P22、P25、P26。25 條引物對 9 個雙孢蘑菇待檢菌株均擴增出穩定的條帶，其中多態性條帶在1條～11條；25條ISSR引物對9個雙孢蘑菇待檢菌株共擴增出334條穩定性條帶，其中多態性條帶達303條，多態性比率為90.72%。

圖3 引物H6、H8、H9對雙孢蘑菇菌株擴增的ISSR指紋圖譜（從左到右）Fig.3 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H6,H8 and H9(from left to right)

圖4 引物H12、H13、H14對雙孢蘑菇菌株擴增的ISSR指紋圖譜（從左到右）Fig.4 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H12,H13 and H14(from left to right)

圖5 引物H15、H16、H18對雙孢蘑菇菌株擴增的ISSR指紋圖譜（從左到右）Fig.5 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H15,H16 and H18(from left to right)

圖6 引物H19、H20、H21對雙孢蘑菇菌株擴增的ISSR指紋圖譜（從左到右）Fig.6 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H19,H20 and H21(from left to right)

圖7 引物H22、H25、H26對雙孢蘑菇菌株擴增的ISSR指紋圖譜（從左到右）Fig.7 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H22,H25 and H26(from left to right)

圖8 引物H28、H33、P4對雙孢蘑菇菌株擴增的ISSR指紋圖譜（從左到右）Fig.8 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H28,H33 and P4(from left to right)

圖9 引物P19、P22、P25對雙孢蘑菇菌株擴增的ISSR指紋圖譜（從左到右）Fig.9 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers P19,P22 and P25(from left to right)

圖10 引物P26對雙孢蘑菇菌株擴增的ISSR指紋圖譜（從左到右）Fig.10 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers P26(from left to right)

2.3 聚類分析

對擴增產物進行分析，將試驗出現的穩定性條帶進行統計，有條帶的記為1，無條帶的記為0，用NTSYS-pc 2.0軟件進行聚類分析，結果見圖11。

圖11 雙孢蘑菇待檢菌株ISSR多態性的聚類圖Fig.11 Dendrogram of polymorphism of ISSR isolated from Agaricus bisporus strains

由進化樹可以看出，9種雙孢蘑菇分為2大分支，待測菌株沐野1號和晉陽1號在同1個大分支上，已審定品種As4607、As2796、英秀一號、棕秀一號、棕蘑1號、蘑菇176和蘑加1號在同1個大分支上，與待檢測菌株親緣關系較遠，而菌株沐野1號和晉陽1號親緣關系相近，相似系數達0.75。

3結論

本文通過對雙孢蘑菇“沐野1號”菌株形態和ISSR的分析表明，待鑒定的菌株沐野1號和山西境內發現的菌株晉陽1號聚為一大類，與其他所有對照菌株的相似系數為0.54，推測待鑒定菌株沐野1號和山西省境內發現菌株晉陽1號是不同于對照菌株的新菌株。同時，待認定菌株沐野1號與晉陽1號的相似性系數為0.75，推測待鑒定菌株沐野1號為不同的新品種。這為充實我國野生雙孢蘑菇種質資源庫、選育優良雙孢蘑菇新品種奠定了基礎，關于該菌株生長特性和栽培特點還需進一步研究。