異常色譜峰來源排查——色譜儀研發測試過程中的經驗分享

高華云,耿浩然,王豐琳,唐 濤,李 彤*

(1. 大連工業大學, 遼寧 大連 116034; 2. 大連依利特分析儀器有限公司, 遼寧 大連 116023)

高效液相色譜是分析化學領域中最常用的分析工具之一,強大的分離能力使其在化工醫藥、食品安全、環境監測、生命科學等領域有著非常廣泛的應用。但是,相對較弱的定性能力,增加了對儀器研發及測試過程中異常現象的分析難度。

大連依利特分析儀器有限公司自2013年開始研發全新一代的iChrom 5100系列高效液相色譜系統,并于2015年開始投放市場。無論是在樣機的研發測試還是在實際應用過程中,出現過多次色譜峰異常的現象,即經常出現一些可重復的“怪峰”(或稱之為“鬼峰”)。如圖1所示,按照流路順序方向排查流動相、樣品、儀器硬件的問題,找到了部分異常峰的來源,但仍有個別異常峰沒能找到產生原因。如前述,色譜儀自身的定性能力不足,即便是配合使用二極管陣列檢測器(DAD)獲取異常峰的紫外-可見光譜圖,仍然難以確定其具體組成及來源。分析并消除重復出現的異常峰,是儀器研發及應用過程中必須解決的問題。

針對上述問題,我們經過長期的實驗,對不同型號、規格的儀器進行對比,通過科學分析找到了異常峰的一種有代表性的來源,在此分享給分析工作者。

1 異常色譜峰的發現

1.1 多肽類樣品的分析

圖2是某種需要進行大規模制備的多肽樣品譜圖,可以看出,異常峰出現在全部樣品色譜峰之后(35 min左右)。理論上樣品峰之后的異常峰不影響實際樣品的分離以及制備實驗的要求,但是為了藥物研究,有必要知道異常峰的來源以及組成。按照流路順序方向排查,經過多次不同的實驗證實,圖中所示異常并不是樣品沒有完全流出或前一次實驗遺留在色譜柱中的殘留多肽樣品。

1.2 氯代多環芳烴類樣品的分析

圖3是氯代多環芳烴類樣品及以流動相作為空白樣品的譜圖,可以看出存在一組可重復的異常色譜峰(13.5～40.0 min)。氯代多環芳烴是多環芳烴氯化得到的產物,原料和產物結構相對簡單且穩定,理論上不會出現其他雜質。通過標準品比對,目標物氯代多環芳烴峰的保留時間為15.5 min,因此在13.5～18.0 min出現的異常峰會影響目標檢測物氯代多環芳烴峰的定量分析。按照流路順序方向排查,經多次不同條件測試證實,所出現的異常峰現象與樣品進樣與否、色譜柱溫度、儀器硬件等色譜實驗條件無關。

圖 5 氯代多環芳烴類樣品的譜圖分析條件同圖3.

2 異常色譜峰的解析與驗證

為解析異常色譜峰的來源,針對上述實驗結果,按照流路順序方向對流動相、樣品、儀器硬件均進行了替換試驗,同時還考察了不同填料、不同尺寸色譜柱、乙腈-水流動相組成比例、溫度和儲存時間等,均沒有準確找出異常峰的來源。之后對系統流路之外的前處理過程進行考察,更換了不同材質的樣品過濾膜和流動相溶劑過濾膜,最終發現了異常峰的來源——溶劑過濾膜。

在實驗過程中,過濾乙腈所使用的濾膜均為有機濾膜,包括尼龍66、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯3種。但濾膜的化學相容性表顯示,3種濾膜對乙腈的耐受程度不同,其中尼龍66的耐受能力最差。進一步的實驗結果還表明,不同材質的濾膜過濾乙腈后所產生的異常色譜峰存在著顯著的差異,實驗結果參見圖4。材質為尼龍66的濾膜所產生的異常峰響應最大,約為2.5 V; 聚偏氟乙烯濾膜產生的峰高略低; 相對而言,聚四氟乙烯濾膜的測試結果是3種材質中最好的,但是異常峰最少的是不經過濾的乙腈。

在找到異常峰的來源后,對氯代多環芳烴類樣品進行了重新分析,結果如圖5所示,異常峰不再出現。

圖 4 不同濾膜過濾乙腈后基線空白圖(a. 原始圖; b. 局部放大圖)色譜條件同多肽類樣品分析(圖2). 1. 不過膜; 2. 聚四氟乙烯膜; 3. 聚偏氟乙烯膜; 4. 尼龍66.

3 結語

從本驗證實驗結果可以看出,濾膜是文中所述實驗異常色譜峰產生的主要因素,由于不同材質的濾膜對有機相的耐受能力不同,所產生的異常峰峰高之間也存在著顯著的差異。所以,建議在做色譜實驗時,若出現異常色譜峰時,不僅要考慮流路系統上涉及的流動相、樣品及儀器硬件可能帶來的影響,也同樣不能忽略像溶劑過濾膜這類前處理耗材帶來的影響。