新型亞微米親水作用色譜的制備及其在加壓毛細管電色譜中的應用

胡 靜,劉讓東,王薇薇,王 彥,閆 超

(上海交通大學藥學院, 上海 200240)

近些年來,隨著生物醫藥技術、食品安全和環境監測等研究領域的發展,強極性和親水性小分子物質迅速成為藥物、食品分析和生物化學等領域的重要研究對象。反相液相色譜(reversed-phase liquid chromatography, RPLC)作為一種色譜分析技術,被廣泛應用于弱極性及中等極性化合物的分離分析,但強極性和親水性化合物在RPLC上保留很弱,導致分離困難。

1990年,美國科學家Alpert[1]首次提出了親水作用色譜(hydrophilic-interaction chromatography, HILIC)的概念,在此后的二十多年時間里,HILIC迅速發展,為分離強極性和親水性化合物提供技術支持[2],在代謝組學[3]、藥物分析[4,5]、食品分析[6]、中藥現代化[7,8]、環境保護[9,10]等研究領域呈現出獨特的優越性和極強潛力。

新型親水作用固定相是親水色譜領域的研究熱點之一,離子型固定相表面可與不同性質的帶電基團進行結合[11],具有很好的親水作用。比如半胱氨酸是一種天然的兩性離子化合物,Shen等[12]將其作為功能基團修飾在5 μm二氧化硅微球表面,在低聚糖、多肽及堿性化合物的分離中,表現出良好的分離選擇性。

根據van Deemter方程,降低填料粒徑大小能獲得更好的分離柱效,但同時會帶來反壓過高的問題。加壓毛細管電色譜(pressurized capillary electrochromatography, pCEC)擁有HPLC和CE的雙重機理,采用壓力流和電滲流同時推動樣品和流動相[13],能夠有效解決上述問題。本實驗采用改良St?ber法合成580 nm粒徑大小的二氧化硅亞微米填料,通過“巰基-烯”點擊化學將L-半胱氨酸修飾在其表面,制備新型的亞微米親水色譜填料,并以pCEC為平臺,實現對核苷、酚類、胺類及多肽等極性化合物的分離,為極性及親水性化合物的分離分析提供新的解決思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑材料

TriSepTM-3000加壓毛細管電色譜儀(美國Unimicro Technologies公司),包括溶劑輸送系統、微流控系統、高壓電源、柱上紫外檢測器和數據采集系統;Vario EL Cube元素分析儀(德國Elementar公司); S-4800場發射掃描電鏡(日本電子株式會社); SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司); DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司); KQ5200DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司); DM36-12馬弗爐(上海德恭實業有限公司); JD200-3電子天平(鄭州南北儀器有限公司); TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠); XW-80A渦旋混合器(上海青浦滬西儀器廠); Molcell 1805V摩爾細胞型純水儀(重慶摩爾水處理設備有限公司)。

正硅酸四乙酯(tetraethylorthosilicate, TEOS)、甲苯、無水乙醇、氨水、吡啶、甲醇、丙烯酰胺、硫脲、苯酚、鄰苯二酚、間苯三酚、對甲苯胺和N,N′-二甲基雙丙烯酰胺均為分析純(國藥集團化學試劑公司);丙酮(分析純,上海凌峰化學試劑有限公司);偶氮二異丁腈(azobisisobutyronitrile, AIBN,純度99%,上海試四赫維化工有限公司);乙腈(色譜純,Tedia公司);乙烯基三氯硅烷(vinyltrichlorosilane, VTMS,純度98%)、L-半胱氨酸(純度99%)、尿嘧啶(純度98%)、胞嘧啶(純度99%)、尿苷(純度99%)、肌苷(純度99%)、胞苷(純度99%)和鳥苷(純度99%)(北京百靈威科技有限公司);精氨酸加壓素(純度99%)、催產素(純度98%)和Met-enkephalin肽(純度98%)(生工生物工程(上海)股份有限公司);石英毛細管(100 μm i. d.,永年縣銳灃色譜器件有限公司)。

1.2 亞微米單分散的二氧化硅微球的合成

580 nm亞微米單分散二氧化硅微球的合成:以文獻[14]方法為基礎,本試驗的具體合成過程為:配置15 mL 28%(質量分數)的濃氨水、24.75 mL超純水和一定體積無水乙醇的混合溶液,加入圓底燒瓶中,混合均勻,置于油浴鍋控溫攪拌,配置10 mL正硅酸四乙酯和無水乙醇的混合溶液,快速加入圓底燒瓶,高速攪拌1 min后降低攪拌速度,封口反應2 h。反應完畢后將反應液轉移至燒杯中,用濃鹽酸調pH至中性,超純水浮選多次至超純水層無明顯懸浮顆粒為止。洗滌抽濾,于65 ℃烘箱中干燥過夜,馬弗爐中煅燒3次,備用。

1.3 半胱氨酸功能基團的修飾

將經濃硝酸活化的580 nm亞微米二氧化硅微球混懸于無水甲苯中,依次加入VTMS、吡啶,常溫下磁力攪拌反應12 h,反應結束后依次用乙醇、丙酮洗滌,抽濾,干燥,得到反應產物VTMS-SiO2。將適量VTMS-SiO2混懸于甲醇-水溶液中,加入半胱氨酸、AIBN,于65 ℃下反應24 h,反應結束后抽濾并依次用超純水和甲醇清洗,得到反應產物Cys-VTMS-SiO2。

1.4 毛細管色譜柱的制備

截取一定長度100 μm內徑的毛細管,活化,氮氣吹干備用。采用高壓勻漿法將水混懸的新型580 nm亞微米固定相Cys-VTMS-SiO2裝入毛細管中,填充至所需有效長度,燒結柱塞和窗口,備用。

表 1 溫度、攪拌速度和反應時間對微球粒徑大小的影響

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2 結果與討論

2.1 亞微米二氧化硅微球的制備與表征

2.1.1亞微米二氧化硅微球的合成優化

St?ber等[15]采用正硅酸四乙酯為原料合成硅顆粒,本實驗室[14,16]通過一系列的條件優化,合成出了單分散亞微米二氧化硅微球。本實驗將進一步優化實驗方法,考察反應溫度、攪拌速度和反應時間對合成結果的影響。其中,反應溫度和攪拌速度對粒徑大小影響顯著(見表1)。反應1～6考察了反應溫度對粒徑大小的影響,反應溫度低于20 ℃會產生團聚現象,在26 ℃后微球粒徑大小隨著溫度的升高而逐漸降低。反應7～10考察了攪拌速度對粒徑大小的影響,攪拌速度過快或過慢均不利于微球的生長,在650 r/min時粒徑大小可達到(577±6) nm。反應11～13考察了反應時間對粒徑大小的影響,結果表明,當微球生長到一定大小后反應時間不會對粒徑產生顯著影響。

在反應溫度為26 ℃,攪拌速度為650 r/min,反應時間為2 h的條件下,合成580 nm亞微米二氧化硅微球,掃描電鏡(SEM)圖如圖1所示,顯示合成的微球表面光滑、粒徑均勻且單分散。

圖 1 580 nm亞微米二氧化硅微球的電鏡掃描圖Fig. 1 Scanning electron microscopy (SEM) imageof the 580 nm submicron SiO2particles

2.1.2亞微米二氧化硅微球的表面修飾與表征

進一步通過“巰基-烯”點擊化學將半胱氨酸鍵合到亞微米二氧化硅微球表面,形成新型親水作用色譜固定相,修飾路徑見圖2。

圖 2 580 nm亞微米二氧化硅微球的L-半胱氨酸修飾的合成Fig. 2 Synthesis of L-cysteine modified580 nm submicron SiO2particles VTMS: vinyltrichlorosilane; AIBN: azobisisobutyronitrile.

采用元素分析法測定中間產物VTMS-SiO2和最后產物Cys-VTMS-SiO2的含碳量分別為0.35%和7.93%,說明半胱氨酸功能基團被成功鍵合到了微球表面。根據圖3可知,該Cys-VTMS-SiO2微球的比表面積為8.383 m2/g,孔徑為3.055 nm,總孔容積為0.023 m3/g。根據比表面積數據和元素分析結果計算得到該二氧化硅微球的碳載樣量為157.66 μmol/m2。

圖 3 580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2的(a) N2吸附-解吸附圖和(b)孔徑分布圖Fig. 3 (a) N2adsorption-desorption isotherm plot and (b) pore size distribution curve of the 580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2

利用傅里葉紅外儀對半胱氨酸修飾后的Cys-VTMS-SiO2微球進行表征,結果見圖4。同純SiO2微球相比,Cys-VTMS-SiO2的紅外譜圖出現很多新吸收峰。其中3 433.56 cm-1處的吸收峰為N-H伸縮振動,1 585.02 cm-1處的吸收峰為N-H面內彎曲振動,810.07 cm-1處的吸收峰為N-H面外彎曲振動,1 338.83 cm-1處的吸收峰為C-N伸縮振動,3 031.41 cm-1處的吸收峰為O-H伸縮振動,1 297.57 cm-1處的吸收峰為C-O伸縮振動,1 620.87 cm-1處的吸收峰為C=O伸縮振動,964.30 cm-1為C-S伸縮振動,這些吸收峰的存也反映了半胱氨酸功能基團的成功修飾。

將修飾好的580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2微球裝入毛細管色譜柱中,如圖5所示,色譜柱裝填緊密,狀態良好。

圖 4 580 nm亞微米SiO2和Cys-VTMS-SiO2的傅里葉紅外光譜圖Fig. 4 FT-IR spectra of the 580 nm submicronSiO2and Cys-VTMS-SiO2

圖 5 毛細管柱的電鏡掃描圖Fig. 5 SEM image of the capillary column

2.2 580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2色譜填料的親水機理考察

為了考察580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2色譜填料的親水作用分離機理,選擇丙烯酰胺和硫脲兩種物質為分離對象,測定保留時間與有機相濃度之間的關系,結果見圖6。

在高有機相條件下(φ(ACN)>93%)下,丙烯酰胺和硫脲的保留呈現親水相互作用的保留機理,即保留時間隨有機相比例增加而增加;另外,這兩個物質在亞微米Cys-VTMS-SiO2色譜柱上的出峰順序也表現為極性小的丙烯酰胺先出峰,極性大的硫脲最后出峰,符合親水色譜的機理。

2.3 580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2親水色譜柱分離性能的考察

選用甲苯、丙烯酰胺和硫脲為分離對象,以毛細管液相色譜(cLC)和pCEC兩種分離模式為平臺,對本研究合成的亞微米Cys-VTMS-SiO2親水色譜柱的分離性能進行考察。

圖 6 580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2毛細管填充柱親水作用機理考察Fig. 6 Investigation of hydrophilic mechanism on the 580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2packed capillary column Column: 20 cm (effective length, 45 cm total length)×100 μm i. d.; mobile phase, pH 6.01 ACN/H2O containing 100 mmol/L ammonium formate solution; back pressure, 14.4 MPa; detection wavelength, 254 nm.

2.3.1施加電壓和流速對分離的影響

圖 7 (a)電壓和(b)流速對580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2毛細管填充柱分離的影響Fig. 7 Effects of (a) voltages and (b) flow rates on the separation of capillary column packed with580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2 Column: 20 cm (effective length, 45 cm total length)×100 μm. (a) Mobile phase, ACN-H2O (98∶2, v/v) containing 100 mmol/L ammonium formate, pH 6.01; applied voltage, 0 to -15 kV; back pressure, 14.4 MPa; (b) mobile phase, ACN-H2O (96∶4, v/v) containing 100 mmol/L ammonium formate, pH 6.01; applied voltage, -15 kV; detection wavelength, 254 nm. Peak Nos.: 1. toluene; 2. acrylamide; 3. thiourea.

分別在cLC(0 kV)和pCEC(-5 kV到-20 kV)模式下對3種化合物進行分離,結果(見圖7a)表明,施加電壓能顯著縮短保留時間,且電壓越大,出峰時間越快。pCEC模式下,柱塞型電滲流驅動力和拋物線型壓力流驅動力聯合驅動樣品的分離,大大提高了分離效率[12]。當施加電壓達到-10 kV時,分離度達到最大值,但電壓繼續增加到-15 kV時,分離度又逐漸降低,可能是樣品和固定相的作用時間減少及產生焦耳熱所致,因此最終選擇-10 kV電壓對3種物質進行分離。

考察了流速對亞微米Cys-VTMS-SiO2親水色譜柱分離性能的影響,結果(見圖7b)表明,增加流速,分離時間縮短,分離度變化不大,綜合考慮時間和分離度,選擇0.08 mL/min為后續實驗的流速值。

2.3.2緩沖鹽濃度對分離的影響

在不同緩沖鹽濃度條件下,3種物質均能達到基線分離(見圖8a)。隨著緩沖鹽濃度的降低,分離度逐漸增大,但當甲酸銨緩沖鹽濃度為5 mmol/L時,硫脲的峰形很寬且有拖尾現象;隨著緩沖鹽濃度的增加,峰形得到明顯改善,達到100 mmol/L時峰形最佳,推測除了緩沖液濃度對電流的影響外,本文合成的親水色譜填料表面的半胱氨酸可能具有一定的離子交換作用。

2.3.3緩沖液pH對分離的影響

分別采用pH=3.86、4.50、6.01和9.04的緩沖液分離甲苯、丙烯酰胺和硫脲。結果表明,3種物質在不同pH條件下均能達到基線分離,但分離度有所變化(見圖8b)。從離子交換機理推測分離度改變的原因,由于色譜柱表面半胱氨酸的等電點為5.05,當pH值較低時弱陰離子交換的分離機制發揮作用;隨著pH逐漸接近等電點,分離度逐漸變小(3種物質在pH 4.5的分離度小于pH 3.86);當pH大于等電點時,隨著pH的增大,分離度不斷增加,保留時間也逐漸變長,可能是因為弱陽離子交換的分離機制開始發揮作用。

2.3.4日內和日間重現性考察

采用甲苯、丙烯酰胺和硫脲為標記物,考察毛細管色譜柱的重現性,日內(n=6)保留時間的相對標準偏差分別是1.1%、0.8%和1.0%,峰面積的相對標準偏差分別為2.0%、1.1%和2.0%;日間(n=3)保留時間的相對標準偏差分別是1.1%、0.9%和1.0%,峰面積的相對標準偏差分別為0.5%、2.0%和2.0%。取3個批次的色譜柱,甲苯、丙烯酰胺和硫脲保留時間的相對標準偏差分別是0.8%、0.2%和1.2%,峰面積的相對標準偏差分別為3.8%、5.0%和2.0%?？梢娒毠苡H水Cys-VTMS-SiO2色譜柱在pCEC模式下具有良好的重現性,且該色譜柱制備方法重現性好,批次間的差異小,成功率高。

圖 8 (a)緩沖鹽濃度和(b)緩沖鹽pH對580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2毛細管填充柱分離的影響Fig. 8 Effects of (a) buffer concentrations and (b) buffer pHs on the separation ability ofthe capillary column packed with 580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2 Column: 20 cm (effective length, 45 cm total length)×100 μm i. d. Mobile phases: (a) ACN-H2O (98∶2, v/v) containing ammonium formate of 5 to 100 mmol/L, pH 6.01; (b) ACN/H2O (98∶2, v/v) containing 100 mmol/L ammonium formate, pH 3.86 to 9.04. Applied voltage: -10 kV; back pressure: 14.4 MPa; detection wavelength: 254 nm. Peak Nos.: 1. toluene; 2. acrylamide; 3. thiourea.

2.4 新型親水作用毛細管填充柱的應用

通過在pCEC模式下分離核苷類、酚類、胺類和多肽化合物,進一步考察新型毛細管兩性離子毛細管填充柱在極性化合物分離中的應用。

2.4.1核苷類化合物的分離

對尿嘧啶、胞嘧啶、尿苷、肌苷、胞苷和尿苷組成的核苷類混合物進行分離,來考察親水色譜柱的性能。圖9a顯示這6種化合物在20 min內能被快速有效分離。分離條件為:流動相為pH=6.3的乙腈-25 mmol/L甲酸銨(93∶7, v/v)緩沖溶液;施加電壓為-18 kV;壓強為15.2 MPa。

2.4.2酚類化合物的分離

在pCEC模式下對酚類化合物進行分離,在11 min內實現了苯酚、鄰苯二酚和間苯三酚的快速分離(見圖9b),且出峰順序與其極性相關,極性越大,保留時間越長。分離條件為:流動相為pH=6.3的乙腈-25 mmol/L甲酸銨(98∶2, v/v)緩沖溶液;施加電壓為-10 kV;壓力為16.3 MPa。

2.4.3胺類化合物的分離

在pCEC模式下對酚類化合物進行分離,在12 min內實現了對甲苯胺、N,N′-二甲基雙丙烯酰胺和硫脲的快速分離,出峰順序與化合物極性相關,極性越大,保留時間越長(見圖9c)。分離條件為:流動相為pH=6.3的乙腈-25 mmol/L甲酸銨(98∶2, v/v)緩沖溶液;施加電壓為-10 kV;壓力為15.8 MPa。

2.4.4多肽類化合物的分離

新型親水作用色譜柱在ACN-H2O(40∶60, v/v,含25 mmol/L甲酸銨)流動相條件下,實現了對3種多肽混合物的分離,在pCEC模式下,隨著施加電壓的增大,保留時間縮短,柱效最高可達145 000 plates/m,分離圖譜見9d。

圖 9 核苷類、酚類、胺類和多肽類化合物在580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2毛細管填充柱上的分離Fig. 9 Separation of (a) nucleosides, (b) phenols, (c) amides, and (d) peptides on the column packed with 580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2

3 結論

通過條件優化合成不同粒徑的亞微米二氧化硅微球,選擇580 nm亞微米粒徑大小的微球作為基質,兩步反應將兩性離子化合物半胱氨酸修飾到微球表面,合成均勻且粒徑單分散的新型亞微米兩性離子親水作用色譜固定相(Cys-VTMS-SiO2)。將甲苯、丙烯酰胺和硫脲作為親水作用色譜柱性能考察的分離物質,以pCEC為平臺,通過對電壓、緩沖鹽濃度和緩沖液pH進行優化,實現化合物的分離研究。將填充柱成功用于核苷類、酚類、胺類和多肽化合物的快速分離,柱效高,為極性化合物和親水化合物的分離研究提供了新方法和新思路。