單程直驅超高壓納升泵的研制與評價

楊三東,董智勇,韓 雪,馬 周,唐 濤,王風云,李 彤*

(1. 南京理工大學工業化學研究所, 江蘇 南京 210094; 2. 大連依利特分析儀器有限公司,遼寧 大連 116023; 3. 大連市色譜工程技術研究中心, 遼寧 大連 116023)

高效液相色譜儀(HPLC)是分析化學領域應用最廣、發展最快的分析儀器之一。隨著生命科學的發展,在蛋白質組學、代謝組學、脂質組學等領域,HPLC被越來越多地應用于生物組織的分析研究[1-3]。納升液相色譜系統是分析生物樣品的常用工具,通過使用更細內徑的色譜柱和流體管路,可以有效降低系統中樣品的擴散,提高分析的質量靈敏度,且能夠直接與質譜儀聯用[4-6]。

納升液相色譜系統的使用流速通常在每分鐘幾百納升,如此低的流速難以通過常規輸液泵直接實現[7]。利用三通將常規輸液泵輸出的流速進行分流是實現納升流速最常用的方法,分流比由兩條支路的阻力比決定,且與阻力比呈倒數[8]。盡管能夠通過較大的分流比實現較低流速的輸出,但由于系統阻力會隨著流動相組成、色譜柱性質、溫度等發生變化,使分流流速不穩定,并且對于梯度洗脫模式來說,阻力小的一端排出的大量流動相難以回收再利用,造成流動相的浪費[9]。因此,研制無分流輸液的納升梯度泵對系統的構建及應用具有重要意義。

商品化納升梯度輸液泵主要有兩種結構設計[10,11],一種是泵腔串聯的連續輸液泵結構,另一種是利用多個切換閥控制流動相流動路徑的注射泵結構,二者都利用高精度電機和流速反饋控制保證輸液精度。但前者的結構中有多個單向閥結構,穩定性較差,后者的結構中有多個切換閥機構,成本較高且控制流程復雜?；谄渌锢硇再|驅動液體的輸液泵也可實現納升流速的輸送。Zhou等[12]利用載流的電滲現象驅動流動相,研制了一種雙元電滲梯度泵,最大輸出流速為490 nL/min,最大輸出壓力可達40 MPa。朱玉川等[13]利用稀土超磁致伸縮材料在磁場中可發生形變的現象發明了一種超磁致伸縮液壓泵,其優點在于輸出流速低,機械結構簡單,但目前尚無實際應用的報道?；谝后w受熱膨脹驅動流動相流動的原理,Tao等[14]構建了一種能夠實現梯度洗脫的熱膨脹泵,在500 nL/min流速條件下,流速重復性的RSD為4%,色譜保留時間重復性的RSD為2%,將膨脹介質水的溫度從25 ℃提高至95 ℃時,輸液壓力可達100 MPa。本課題組[15]基于物質發生固液相變時體積改變的現象發明了一種相變輸液泵,其輸液流速低至100 nL/min,最大耐壓可達80 MPa。上述幾種輸液泵雖然能夠以納升級流速輸送流動相,但系統的穩定性,控制的復雜程度均制約其進一步的應用。

本文利用高精度直驅電機和一個高壓兩位十通切換閥構建了一種單程直驅超高壓納升泵,簡稱納升泵,對其輸液性能進行了評價,并構建了一套能夠用于蛋白質組學研究的納升液相色譜系統。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

納升泵(自構建), P230Ⅱ高壓恒流泵(大連依利特分析儀器有限公司),兩位六通閥C72X-6696EH(配5 μL定量環)、兩位十通閥C82X-6670EUD(瑞士VICI公司), nF-1500微納流量計(大連依利特分析儀器有限公司), K2501紫外檢測器(20 nL檢測池,德國Knauer公司), LTQ XL質譜儀、Q Exactive質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

末端錐形的C18毛細管分離柱(150 mm×75 μm, 5 μm)、C18捕集柱(30 mm×150 μm, 5 μm)(中國科學院大連化學物理研究所1810組提供)。甲酸、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶(Trypsin, bovine pancreas)、牛血清白蛋白(BSA)均為分析純,購自美國Sigma公司;丙酮、碳酸氫銨均為分析純,購自天津科密歐公司。乙腈(色譜純)購于德國Merck公司,蛋白質質量濃度為0.25 g/L的Hela細胞蛋白質提取液由中國科學院大連化學物理研究所1810組提供。超純水(Milli-Q,德國Millipore公司)。

1.2 樣品制備

BSA酶解液:取1 mg BSA溶于1 mL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液中,配置成1 g/L的BSA溶液。將1 mL BSA溶液(1 g/L)置于90 ℃水浴中熱變性15 min,然后加入8 μL 1 mol/L DTT,在56 ℃水浴中反應1 h,之后避光加入20 μL 1 mol/L IAA,避光靜置40 min,最后加入40 μL 1 g/L trypsin(酶與蛋白質的質量比為1∶25),在37 ℃水浴下反應10 h。反應結束后,加1 μL甲酸終止酶解,即得到質量濃度為1 g/L的BSA酶解液。

Hela細胞蛋白質酶解液:將1 mL 0.25 g/L Hela細胞蛋白質提取液置于90 ℃水浴中熱變性15 min,然后加入8 μL 1 mol/L DTT,在56 ℃水浴中反應1 h,之后避光加入20 μL 1 mol/L IAA,避光靜置40 min,最后加入40 μL 1 g/L trypsin(酶與蛋白質的質量比為4∶25)在37 ℃水浴下反應16 h。反應結束后,加1 μL甲酸終止酶解,即得到質量濃度為0.25 g/L的Hela細胞蛋白質酶解液。

1.3 納升泵輸液評價

1.3.1納升流速測試

納升泵出口與nF-1500微納流量計相連,流動相A、B均為純水,分別設定A、B泵頭的流速為50、100、150、200、300、500、700和1 000 nL/min,測試實際的輸液流速,計算實際流速與設定流速的偏差以及瞬時流速穩定性的RSD值。

1.3.2納升泵耐壓測試

用絲堵堵住納升泵的出口,流動相A、B均為純水,同時設置A、B泵頭的流速為5 μL/min進行升壓,監控并記錄兩泵頭平均壓力隨時間的變化情況。

1.3.3納升泵梯度測試

納升泵出口直接與K2501紫外檢測器的檢測池相連,流動相A為純水,流動相B為0.6%(體積分數,下同)丙酮水溶液。線性梯度測試條件:0～2 min, 100%A; 2～32 min, 100%A～100%B; 32～50 min, 100%A。臺階梯度測試條件:0～5 min, 5%B; 5～15 min, 20%B; 15～25 min, 35%B; 25～35 min, 50%B; 35～45 min, 65%B; 45～55 min, 80%B; 55～65 min, 95%B; 65～80 min, 5%B。流速:500 nL/min,檢測波長:254 nm。

1.4 納升液相色譜系統的構建與評價

1.4.1納升液相色譜系統的構建

基于捕集柱進樣的納升液相色譜系統如圖1所示。進樣系統由兩個切換閥組成,兩位六通閥處于虛線位時樣品進入定量環,處于實線位時樣品從定量環被P230Ⅱ輸送至下一個切換閥。兩位十通閥采用雙捕集柱結構,虛線位時右捕集柱進行樣品富集及在線除鹽,左捕集柱進行樣品洗脫,實線位時兩個捕集柱狀態交換。由納升泵對富集樣品后的捕集柱進行梯度洗脫,并在C18毛細管分離柱上進行進一步分離,最后進入質譜進行檢測。

圖 1 納升液相色譜系統流路示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the nano liquidchromatography system 1. P230Ⅱ high pressure constant flow pump; 2. two-position-six-port valve; 3. sample needle; 4. two-position-ten-port valve; 5. nano pump; 6. trap column; 7. capillary separation column; 8. mass spectrometry.

1.4.2納升液相色譜系統的評價

分析BSA酶解液的條件如下。利用兩位六通閥手動進樣1 μg BSA酶解液,捕集流速為3 μL/min,捕集時間為10 min。捕集結束后切換十通閥,由納升泵對捕集柱進行梯度洗脫。捕集流動相與納升泵梯度洗脫的流動相A相同,為98%水+2%乙腈+0.1%甲酸,流動相B為98%乙腈+2%水+0.1%甲酸。分離梯度條件為:0～30 min, 5%B～40%B; 30～40 min, 80%B; 40～45 min, 80%B～5%B; 45～60 min, 5%B。流速為500 nL/min。用LTQ XL質譜儀檢測。

質譜檢測條件:掃描范圍為m/z400～1 800,正離子掃描模式,噴霧電壓為1.5 kV,毛細管加熱溫度為200 ℃,歸一化碰撞能量為35%。

數據庫檢索方法:質譜采集的原始文件通過pXtract轉換后,用Mascot(2.4.0版,MatrixScience公司)軟件對序列進行檢索。參數設置:母離子質量容差為0.5 Da;碎片離子質量容差為1 Da;蛋白質水解酶為Trypsin;最多允許2個漏切位點;固定修飾為carbamidomethyl (C);可變修飾為oxidation (M)和acetyl (protein N-term)。

分析Hela細胞蛋白質酶解液的條件如下。Hela細胞蛋白質酶解液的進樣量為1.25 μg。捕集條件同BSA。分離梯度條件為:0～50 min, 5%B～25%B; 50～65 min, 25%B～45%B; 65～70 min, 45%B～80%B; 70～80 min, 80%B; 80～90 min, 5%B。流速為600 nL/min。用Q Exactive質譜儀檢測。

質譜檢測條件:掃描范圍為300～2 000m/z,正離子掃描模式,噴霧電壓為2.0 kV,毛細管加熱溫度為250 ℃,歸一化碰撞能量為35%。

數據庫檢索方法:質譜采集的原始文件利用Proteome Discoverer ver.2.1.1.21進行數據庫檢索。參數設置:母離子質量容差為20 ppm (10-6);碎片離子質量容差為20 mDa;蛋白質水解酶為Trypsin;最多允許2個漏切位點;固定修飾為carbamidomethyl (C);可變修飾為oxidation (M)和acetyl (protein N-term)。

2 結果與討論

2.1 納升泵的結構設計

為了實現納升流速下的穩定輸液,選用了一種高精度直驅步進電機作為泵頭內柱塞桿的驅動機構。設計了一種專用夾頭[16],將電機與柱塞桿剛性連接,無其他傳動機構,因此電機的運動精度能夠直接表現為柱塞桿的運動精度。電機的運動精度為每脈沖0.032 μm,最大推力為300 N,選用直徑2 mm的柱塞桿時,理論上輸液精度為0.1 nL/脈沖,最大壓強為95.5 MPa。納升泵的整體設計基于注射泵的結構,圖2為結構示意圖,圖3為裝置實物圖。泵頭上只設置一個流動相出入口,取消了傳統的單向閥結構,輸液與吸液的狀態切換通過兩位十通閥實現。十通閥的4個孔用絲堵堵住,其余6個孔通過管路分別與兩個溶劑瓶、兩個壓力變送器以及混合三通的兩個入口相連。

圖 2 納升泵結構示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the structureof the nano pump 1. pump head A; 2. pump head B; 3. pressure transmitter PA; 4. pressure transmitter PB; 5. mobile phase bottle A; 6. mobile phase bottle B; 7. two-position-ten-port valve; 8. mix tee.

圖 3 納升泵實物圖Fig. 3 Photograph of the real nano pump

當納升泵對外輸液時,兩個泵頭輸出的流動相經過各自的壓力變送器進入兩位十通閥,并通過十通閥的內部通道進入混合三通。由于此狀態下連接兩個溶劑瓶的管路在兩位十通閥處與絲堵相通,因此溶劑瓶及管路中的液體不會自發流動。當納升泵吸液時,兩位十通閥切換狀態,此時A、B溶劑瓶的管路在兩位十通閥處分別與A、B壓力變送器相通,泵頭內由于柱塞桿向后運行形成了負壓,使溶劑瓶中的流動相被吸入泵頭中,實現對泵頭流動相的補充,完成吸液。同時,與混合三通入口相連的兩個管路在十通閥處與絲堵相通,因此能夠在一定程度上減小混合三通出口外系統的壓力突變,防止因系統壓力突變引起的色譜柱柱床損傷。

通常情況下,梯度輸液泵需要在兩相接觸的三通之后連接混合器以提高混合效果,但在納升流速條件下,常規的混合器結構均會帶來明顯的梯度延遲,甚至可能因為混合體積過大,導致無法實現準確的梯度輸液。本文所研制的納升泵采用三通直接混合的方式,以三通的中心作為混合區域,利用流動相的分子擴散和局部渦流實現納升流速下的流動相混合,減小了梯度延遲。

2.2 納升泵的性能評價

2.2.1納升泵流速測試

常規的毫升級流速測量可使用質量法或體積法,即測量一段時間內流出的液體質量或體積來計算輸出流速,但對于納升級的流速來說,這兩種方法均不適合。實驗所用的流速測量裝置是一種基于溫度傳感的瞬時微流量計,與常規的質量法或體積法不同,這種流量計能夠以較高的采樣頻率測量流體的瞬時流速,因此更適合用來測試輸液泵納升級輸出流速的準確性和穩定性[17]。在不同的設定流速下,A、B泵輸出的實際流速、相對誤差以及穩定性RSD值如表1所示。測試結果表明,實際流速與設定流速的線性相關性良好,決定系數(R2)達到0.999 98。流速的相對誤差優于1.71%,在常用流速500 nL/min條件下的相對誤差低于1%。流速穩定性RSD值均優于2.83%,在常用流速500 nL/min條件下的RSD值低于0.7%。說明所構建的納升泵瞬時輸液流速偏差小,穩定性好,可以滿足納升級恒流輸液的要求。

表 1 納升泵不同流速條件下的相對誤差及穩定性(RSDs)(n=300)

2.2.2納升泵耐壓測試

通常實驗所用的毛細管色譜柱背壓一般都在20 MPa以下,但為了提高分離效率和分離度,使用更細粒徑的亞2 μm填料裝填毛細管柱或裝填更長的毛細管柱是常用的手段,這會使色譜柱背壓顯著提高,因此需要輸液泵也能提供較高的輸液壓強。納升泵的壓力測試結果如圖4所示。從圖中可以看出,隨著柱塞的不斷運動,系統的壓力逐漸升高,最終達到壓力變送器的最大測量值100 MPa。由于電機的額定參數一般會留出20%左右的余量以防止電機在超負荷下工作造成損壞,因此實測的最大輸液壓強高于理論計算值。此外,泵頭取消了單向閥結構,無需考慮閥球閥座超高壓下的密封性問題,中心的兩位十通閥同樣具有100 MPa以上的耐壓能力,保證了所構建納升泵的系統密封性良好,滿足超高壓下使用的需求。

圖 4 納升泵壓力測試結果Fig. 4 Pressure testing result of the nano pump

2.2.3納升泵梯度測試

梯度洗脫是液相色譜常用的分離方法,主要有線性梯度和臺階梯度兩種模式。對輸液泵進行梯度測試能夠反映輸液泵梯度輸液的準確性、梯度變化的均勻性和梯度延遲。

納升泵梯度測試的結果如圖5所示。圖5a中,線性梯度3次測試的重復性良好,梯度線性階段變化均勻。在流動相比例開始發生變化時,B相的流速極低,只有每分鐘幾納升的瞬時流速,但梯度曲線中并未發現梯度突變,這表明低比例下B相的輸液流速基本能夠均勻變化,進一步驗證了直驅電機的運動精度能夠滿足納升流速輸液的需求。梯度延遲體積大約在0.7 μL左右,這部分體積可能是由混合三通的混合處、三通至檢測池的連接管路、接頭等共同組成。采用流動相比例分段變化的臺階梯度可以得到輸液泵的梯度準確性信息,在圖5b的臺階梯度測試結果中,根據各臺階的平均信號值,計算得到梯度比例偏差在1%以內(見表2)。

圖 5 (a)線性(3次)與(b)臺階梯度測試結果Fig. 5 Results of (a) linear gradient (3 times)and (b) step gradient

表 2 臺階梯度準確性(n=3)

2.3 納升液相色譜系統的評價

BSA是蛋白質組學研究中最常用的評價物質,多用來評價蛋白質酶解效率或分析裝置的性能[18,19]。根據圖1構建納升液相色譜系統,將1 μg BSA酶解液進樣分離,得到一級譜的基峰色譜圖。如圖6所示,從圖中可以看出色譜峰的分布比較均勻,從9 min至37 min均有肽段被檢測出來。數據庫檢索結果表明,圖6中BSA的蛋白質序列覆蓋率可達45%,與文獻[18,19]結果相當。

圖 6 BSA酶解液的基峰色譜圖Fig. 6 Base peak chromatogram of the bovine serumalbumin (BSA) digests

Hela細胞是一種宮頸癌細胞,廣泛應用于腫瘤研究、分子生物學研究或細胞培養研究。因其細胞內的蛋白質種類繁多,可用于評價蛋白質提取方法、酶解方法、蛋白質組分析方法或質譜儀器的性能[20,21]。將1.25 μg Hela細胞蛋白質酶解液進樣分離,得到如圖7所示的一級譜基峰色譜圖。對質譜采集數據進行數據庫檢索,共匹配到2 809個蛋白質,與文獻[20,21]中鑒定的數目相當。通過BSA酶解液與Hela細胞蛋白質酶解液的分離分析結果可以發現,所構建的納升液相色譜系統能夠應用于蛋白質組學的分析研究中。

圖 7 Hela細胞蛋白質酶解液的基峰色譜圖Fig. 7 Base peak chromatogram of the Hela cell digests

3 結論

利用高精度直驅步進電機和兩位十通閥研制了一種能夠以納升流速進行梯度輸液的色譜輸液泵。通過流速準確性和穩定性測試,表明該納升泵能夠以極高的流速精度進行納升流速穩定輸液,梯度偏差低于1%,流速準確性和穩定性均可達到商品化儀器的水平。納升泵的耐壓能夠達到100 MPa,可用于納升超高效液相色譜系統中。進一步利用該納升泵構建納升液相色譜系統,通過對BSA酶解液和Hela細胞蛋白質酶解液進行分離分析和鑒定,得到與文獻報道結果相近的序列覆蓋率和蛋白質鑒定數目。說明所研制的納升輸液泵能夠滿足蛋白質組學、代謝組學等領域應用的輸液要求。

圖 1液相色譜系統流路結構示意圖
1. 系統組織器; 2. 高壓恒流泵; 3. 自動進樣器; 4. 柱溫箱;
5. 檢測器.

圖 2多肽類樣品分析譜圖
流動相: 乙腈-水(均含0.1%(v/v, 下同)三氟乙酸), 梯度洗 脫(0～5 min, 20%乙腈; 5～20 min, 20%～90%乙腈; 20～30 min, 90%乙腈; 30～30.1 min, 90%～20%乙腈); 流速: 0.8 mL/min; 檢測波長: 214 nm; 進樣量: 20 μL; 柱溫: 40 ℃.
1. 樣品峰; 2. 異常峰.