基于凝膠過濾色譜的β2微球蛋白標準品單體定量檢測方法

暴曉博,任 軍,王玉鳳,賈凌云*

(1. 大連理工大學生物工程學院, 遼寧 大連 116023;2. 康元醫療科技(大連)有限公司, 遼寧 大連 116000)

腎臟病是嚴重危害人類健康的重大慢性疾病。相關流行病學資料顯示,我國人群中慢性腎臟病(CKD)的發生率約為11%～13%[1]。透析相關淀粉樣變是經過長期透析治療的腎病患者常見的并發癥。該癥主要表現為關節和關節周圍組織的淀粉樣沉積,導致骨和關節的致殘性病變[2]。該并發癥的發病率隨透析年齡和患者年齡增長而增加。淀粉樣物質還可以沉積于消化道和心血管,引起吞咽痛、消化道出血、腸梗阻和心肌淀粉樣變,嚴重者可死于充血性心力衰竭。

血液中β2微球蛋白(beta-2-microglobulin, B2M)的水平升高導致的淀粉樣沉積是透析相關淀粉樣變的顯著特征[3]。B2M是1968年瑞典Berrgard等[4]首先從腎小管蛋白尿中分離發現的由100個氨基酸殘基組成的單鏈多肽,相對分子質量為11.8 kDa。在健康人體內B2M以相對穩定的速率合成和代謝,血清中的含量一般為1.5～3 mg/L[5]。腎病患者由于腎臟功能受損,導致體內生成的B2M無法代謝,而常規透析等手段很難去除B2M這種中分子物質[6],長期透析的腎病病人血清中的B2M含量可以達到20～50 mg/L,血清中高濃度的B2M導致透析相關淀粉樣變的發生。因此,研究B2M單體的聚集過程對于預防和治療透析相關淀粉樣變具有重要的意義[7]。此外,對B2M的透析過濾效果也是表征高通量血液透析器毒素透過性能的重要質量指標之一。上述兩方面的應用需求都對B2M標準品的質量提出了較高的要求。

評估血液透析器的透過效率需要使用B2M作為標志物,使用商業化的B2M試劑盒(通過抗原抗體結合的原理進行檢測[8,9])檢測透析前后血漿中的B2M濃度來計算透過效率。由于B2M具有較強的疏水性,在制備和儲存的過程中容易形成二聚體。當使用的B2M標準品中有B2M二聚體存在時,由于B2M二聚體相比B2M單體更不易透過血液透析膜,導致對透過效率評價結果的可信度下降。因此,有必要建立B2M標準品生產過程中單體含量的分析方法。

目前,B2M有腎臟病人尿液中提取和基因重組表達兩種來源。由于在產量和生產成本上的優勢,市場上B2M產品多通過基因重組表達獲得[10-12]。B2M標準品純度的檢測采用基于抗體抗原特異性識別的免疫比濁法,該類檢測試劑盒測定的是B2M總量,很難區分出單體、二聚體及多聚體。且市售的試劑盒主要用于臨床診斷,其檢測方法的線性范圍遠小于產品質控中常用的濃度范圍[13,14]。因此,建立一種針對B2M標準品生產過程中單體和聚集體的快速準確定量方法對于B2M的生產及質控具有重要意義。凝膠過濾色譜已經廣泛應用于蛋白質復性過程中聚集體與蛋白質單體的分析[15,16],選擇合適的凝膠過濾色譜條件可以實現對B2M單體的定性定量檢測。

本研究通過凝膠篩分高效液相色譜建立了B2M單體的定量檢測方法,并對方法的精確度和穩定性加以驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

液相色譜Agilent 1200 Series(美國Agilent Technologies);凝膠篩分色譜柱:TSKgel SuperSW2000(30 cm×4.6 mm, 4 μm,日本Tosoh Bioscience); Millipore Elix20超純水系統(美國Millipore);精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

特定蛋白質分析儀及配套B2M免疫比濁檢測試劑盒(石家莊禾柏科技有限公司)。20×磷酸緩沖液(PBS, 0.2 mol/L, pH 7.2～7.4)、Bradford蛋白質濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 單體B2M和二聚體B2M的制備

構建了B2M的重組表達載體B2M-pET23a,并在大腸桿菌BL21中進行表達。對獲得的B2M包涵體進行了復性。復性后的B2M使用AKTA-Purifer100通過Q-Sepharose強陰離子交換介質純化。使用0.01 mol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液上樣。B2M單體洗脫條件:0.1 mol/L NaCl, 0.01 mol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液。B2M二聚體洗脫條件:0.3 mol/L NaCl, 0.01 mol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液。檢測波長為280 nm。

收集不同條件下的洗脫峰,使用非還原十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)初步檢測其純度。單體B2M超濾換液至超純水中,冷凍干燥制成干粉保存。二聚體B2M超濾換液至超純水中,于-20 ℃冷凍保存。

1.3 標準蛋白質溶液的配制

1×PBS的制備:20×PBS(pH=7.4)與超純水按照體積比1∶19的比例混合,混合后經0.22 μm水相濾膜過濾,高溫滅菌,超聲除氣處理。

使用精密分析天平稱取10.0 mg單體B2M干粉,加入20 mL 1×PBS中,充分溶解制成B2M質量濃度為0.50 g/L的蛋白質溶液,使用B2M免疫比濁檢測試劑盒測定溶液中B2M的濃度,測定結果應與理論值誤差小于10%。

1.4 色譜條件

凝膠篩分柱:TSKgel SuperSW2000;柱溫:25 ℃;流動相:1×PBS;進樣體積:10 μL;流速:0.5 mL/min;紫外檢測波長:280 nm。

1.5 凝膠過濾液相色譜對B2M的定性分析

使用非還原SDS-PAGE檢測標準單體蛋白溶液和二聚體樣品的純度。使用Bradford試劑盒測定二聚體樣品中總蛋白質濃度。將標準單體蛋白質溶液與二聚體溶液按體積比1∶1混合,制成混合樣品。標準單體蛋白質溶液、二聚體蛋白質溶液、混合樣品依次經凝膠過濾液相色譜進行樣品純度檢測。

1.6 B2M單體定量檢測方法的建立

1.6.1B2M標準曲線的線性范圍及定量限

將標準溶液用1×PBS逐級稀釋,在設定的色譜條件下進樣測定。以峰面積(y)為縱坐標,B2M的質量濃度(x, g/L)為橫坐標建立標準工作曲線。定量限以10倍信噪比(S/N=10)計算。

1.6.2檢測方法的精密度及穩定性

在B2M質量濃度為0.10 g/L的PBS中添加一定質量(0.10、0.20、0.30 mg)的B2M干粉進行加標回收試驗,計算蛋白質單體回收率和相對標準偏差。每種樣品平行測定3份。

先在二聚體樣品中添加B2M干粉至終質量濃度為0.13 g/L,在此基礎上繼續添加B2M干粉至終質量濃度為0.23、0.33、0.43 g/L,進行加標回收試驗,計算蛋白質單體回收率和相對標準偏差。每種樣品平行測定3份。

將B2M質量濃度為0.20 g/L的1×PBS溶液于室溫放置5 h,每隔1 h取樣,使用凝膠過濾色譜法測量蛋白質濃度。

1.6.3凝膠過濾液相色譜法與免疫比濁試劑盒分析B2M樣品的優勢比較

在二聚體樣品中添加一定質量的B2M單體干粉(終濃度為0.10、0.20、0.30 g/L),分別使用凝膠過濾高效液相色譜法和免疫比濁試劑盒檢測B2M單體濃度。

圖 1 強陰離子交換色譜純化B2MFig. 1 Purification of beta-2-microglobulin (B2M) bystrong anion exchange chromatography Peak 1: B2M eluted by 0.1 mol/L NaCl and 0.01 mol/L Tris-HCl at pH=8.5; Peak 2: B2M eluted by 0.3 mol/L NaCl and 0.01 mol/L Tris-HCl at pH=8.5. UV 280: absorbance at 280 nm; cond: conductivity.

2 結果與討論

2.1 單體B2M和二聚體B2M的制備及檢測

為了進一步的定性分析,需要制備高純度的單體B2M和二聚體B2M。由于B2M在大腸桿菌中基因重組表達形成包涵體,包涵體需要復性后才能得到可溶的B2M。在復性的過程中,有部分B2M會通過分子間二硫鍵形成二聚體,如圖1所示,復性后B2M與強陰離子交換色譜結合后,在0.1 mol/L NaCl (0.01 mol/L Tris-HCl, pH=8.5)和0.3 mol/L NaCl (0.01 mol/L Tris-HCl, pH=8.5)下洗脫收集到兩個洗脫峰。經還原SDS-PAGE檢測,如圖2a所示,兩個洗脫峰分子量均位于B2M單體分子量附近,推測其中一個洗脫峰是分子間二硫鍵形成的二聚體,在還原電泳中由于二硫鍵被還原而表現為單體條帶。B2M單體和二聚體的空間結構不同影響蛋白質表面負電荷密度,導致出現不同的洗脫條件。經過非還原電泳檢測后,如圖2b所示,洗脫峰1的蛋白質相對分子質量約為12 kDa,為B2M單體,純度較高。洗脫峰2主要成分相對分子質量約為23 kDa,是B2M通過分子間二硫鍵形成的二聚體。洗脫峰2中還有少量單體和多聚體B2M存在。

圖 2 還原SDS-PAGE和非還原SDS-PAGE檢測B2M純度Fig. 2 Reduced sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and non-reduced SDS-PAGE of B2M Lane M: low relative molecular mass protein marker; lane 1: B2M before purification; lane 2: peak 1 in Fig. 1; lane 3: peak 2 in Fig. 1.

將單體B2M超濾換液到超純水中,冷凍干燥制成干粉保存。將二聚體B2M超濾換液到超純水中,-20 ℃冷凍保存。

圖 3 B2M的(a)單體、(b)二聚體及(c)兩者混合樣品的凝膠過濾色譜圖Fig. 3 Gel filtration chromatogram of B2M (a) monomer,(b) dimer, and (c) mixture of monomer and dimer

2.2 凝膠過濾液相色譜對B2M的定性分析結果

制備的單體B2M和二聚體B2M為基于凝膠過濾色譜定性分析B2M樣品奠定了基礎。按1.4節色譜條件進行定性分析。結果如圖3a所示,B2M單體在凝膠過濾色譜上的保留時間約為12 min,峰形尖銳,無雜峰,說明制備的單體蛋白質純度較高。而圖3b所示的B2M二聚體的保留時間約為8 min。兩種蛋白質等體積混合后進樣的色譜結果如圖3c所示,單體和二聚體的峰形尖銳對稱,兩峰無重疊,可以實現基線分離。

圖3b的結果顯示制備的二聚體B2M的純度低于單體,其中含有少量蛋白質單體和多聚體,這與非還原電泳結果一致。二聚體中的單體蛋白質可能是部分二聚體在保存過程中分子間二硫鍵斷裂導致,也可能是在純化過程中未能完全分離單體和二聚體。使用Bradford試劑盒測量二聚體溶液中的總蛋白質質量濃度為0.47 g/L,根據吸收峰面積積分后的結果計算,二聚體溶液中的單體質量濃度約為0.03 g/L,在后續實驗中使用二聚體溶液進行分析時需要將這部分單體濃度計入。

2.3 方法學考察

2.3.1標準曲線的線性范圍及定量限

稱取10.0 mg單體B2M干粉,加入到20 mL的1×PBS中,充分溶解,制成B2M質量濃度為0.50 g/L的蛋白質溶液,使用1×PBS稀釋至B2M質量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.25、0.30和0.40 g/L。不同濃度的樣品依次上樣,得到一系列B2M單體的UV280吸收峰。以積分峰面積(y)為縱坐標,對應的B2M單體的質量濃度(x, g/L)為橫坐標建立標準工作曲線。線性方程為y=29.80x+0.11,相關系數為0.994 8,線性關系良好。線性范圍為0.05～0.50 g/L,定量限為0.08 g/L。標準曲線的線性范圍包含了生產過程中B2M常見的濃度范圍,定量限低于生產過程中B2M的最低濃度,可以用于生產過程中B2M樣品的檢測。

2.3.2精密度及穩定性

為了驗證標準曲線的精密度,向1×PBS溶液和二聚體溶液中添加一定濃度的B2M單體進行加標回收試驗,每種樣品平行測定3份。進行加標試驗前,使用凝膠過濾色譜檢測加入單體干粉后的PBS溶液和二聚體溶液中B2M單體的濃度,檢測出的溶液本底測量值與根據干粉量計算出的本底添加量一致。因此在表1中只列出了溶液的本底測量值。加標試驗結果表明,B2M的平均加標回收率為85.0%～96.7%,相對標準偏差為1.7%～3.3%。結果說明,該檢測方法可以滿足日常質量檢測分析的要求。個別數據回收率較低是由于使用的儀器檢出限較高,在測量的濃度范圍內有效數字位數較少,導致計算出的回收率較低。

由于實驗中所用單通道液相色譜檢測一個樣品所需時間為15 min,當有多個樣品需要測定時,長時間放置在室溫的蛋白質樣品有可能發生降解或聚集,影響檢測結果。為了證實檢測結果的有效性,需要進行檢測方法的穩定性試驗,驗證待測樣品在一定時間內的穩定性。配制0.20 g/L的B2M溶液,在室溫放置5 h,每隔1 h在設定的色譜條件下測定其蛋白質濃度,結果如圖4所示。在5 h內蛋白質濃度測定結果比較穩定,沒有發生蛋白質降解或聚集的情況,說明實驗結果是穩定可信的,測量過程中沒有二聚體生成。

表 1 B2M在磷酸鹽緩沖液(PBS)和二聚體溶液中的加標

2.3.3凝膠過濾液相色譜法與免疫比濁試劑盒分析B2M樣品的優勢比較

模擬了生產及儲存過程中B2M產品形成聚集體的情況來考察建立的B2M單體定量方法的準確性。在B2M二聚體質量濃度為0.40 g/L(其中B2M單體的本底質量濃度為0.13 g/L)的PBS溶液中分別加入終質量濃度為0.1、0.2、0.3 g/L的B2M單體,分別使用凝膠過濾液相色譜法和B2M免疫比濁試劑盒檢測樣品中B2M單體的濃度。結果如表2所示,當溶液中有B2M二聚體時,免疫比濁試劑盒的檢測結果受到較大干擾,測得的溶液本底濃度達到了實際值的4倍左右,進而導致計算加標結果的回收率也產生較大偏差。而凝膠過濾色譜法能夠準確地測量出B2M單體的本底濃度,回收率計算結果也保持良好的準確度,回收率范圍是95%～110%。結果表明,免疫比濁試劑盒無法用于B2M標準品生產過程中的質量監控,而凝膠過濾色譜檢測方法在有二聚體存在的溶液中仍然可以準確定量B2M單體。在實際生產應用中,根據測得的總蛋白質質量與凝聚過濾色譜測得的單體B2M質量,可以計算出樣品中二聚體的含量,進而判斷樣品是否滿足質量要求。

圖 4 B2M樣品的穩定性(n=3)Fig. 4 Stability of the B2M sample (n=3)

表 2 凝膠過濾色譜與免疫比濁試劑盒測定B2M二聚體溶液中單體

3 結論

建立了凝膠過濾色譜定性定量分析B2M單體的檢測方法。本方法主要適用于B2M單體標準品生產過程中產品的質控檢驗,可以滿足B2M標準品生產過程中的純度及定量檢測需求,也可以用于B2M聚集體及聚集過程的相關基礎研究。