多孔芳香骨架吸附劑-固相萃取-高效液相色譜法同時測定辣椒粉中4種偶氮類染料

聞 威,張文芬,張巖皓,趙無垛*,張書勝

(1. 鄭州大學化學與分子工程學院, 河南 鄭州 450001;2. 香港浸會大學化學系環境與生物分析國家重點實驗室, 香港 999077)

近年來,食品安全事件的頻發使工業染料在食品中的非法添加和濫用引起了越來越廣泛的重視。偶氮類染料在印染工業中的應用最為廣泛,占了所有商業染料的50%以上[1]。由于其價格低廉、色澤鮮艷、著色穩定,常被不法商販用作食品染料來代替常規的食用色素[2]。然而偶氮類化合物進入人體后會發生還原或分解,產生易致癌的芳香胺,引起機體病變和誘發癌癥,危害人體健康,我國以及歐盟等國家已禁止在食品中使用該類染料[3,4]。

蘇丹紅染料是一類親脂性苯基偶氮類衍生物,被廣泛用作油、蠟、地板以及油墨中的染色劑[5,6],但其中的偶氮基和芳香環會對人體健康造成傷害,可能引發過敏和哮喘反應、DNA病變和肝癌等癥狀[7-10],國際癌癥研究中心(IARC)已將其歸為三級致癌物[11]。對位紅具有與蘇丹紅相似的化學結構,對皮膚和呼吸系統均有刺激性,一些科學家認為它可能是一種遺傳毒性的致癌物質[12,13]。酸性橙Ⅱ是一種典型的酸性水溶性偶氮染料,會對人體的神經系統、膀胱造成傷害,可能會引發癌癥[14]。因此,建立簡單、高效、快速測定食品中偶氮類染料的方法對保障食品安全及人類健康具有重要意義。

目前,用于不同食品中偶氮類染料的檢測方法有高效液相色譜法[15]、液相色譜-串聯質譜法[16,17]、氣相色譜-質譜聯用法[18]、毛細管電泳法[19]、酶聯免疫測定法[20]等,其中高效液相色譜法因其操作簡單、成本低、重現性好等優點被廣泛應用。考慮到染料在食品中的痕量存在以及樣品基質的復雜性,樣品前處理在整個分析過程中也起著舉足輕重的作用。偶氮類染料檢測的前處理方法有固相萃取[21-23]、液液萃取[24,25]、固相微萃取[26]、分子印跡固相萃取[27]等,其中固相萃取技術作為一種成熟的前處理方法較為受歡迎,而固相萃取富集和凈化效果與固相萃取吸附劑的選擇息息相關。多孔芳香骨架(PAF)作為一種新型的多孔材料,具有均勻的孔徑結構、較大的比表面積以及特殊的分子結構,常被用作固相萃取吸附材料[28,29]。

本文基于具有多重作用位點、自制的PAF-6固相萃取吸附劑,通過其與目標物之間產生氫鍵、π-π共軛等作用力實現了對復雜樣品基質中對位紅、酸性橙Ⅱ、蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ的同時提取富集,建立了一種固相萃取-高效液相色譜同時測定辣椒粉中4種偶氮類染料的方法,結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀,內置G1314VWD紫外檢測器(美國Agilent公司); Cintra2020紫外分光光度計(澳大利亞GBC公司); Sigma3-30臺式高速離心機(美國Sigma公司);姚儀牌TTL-DC Ⅱ型氮吹儀(北京華儀通泰科技有限公司); METTLER TOLEDO Xp205電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);超純水制備儀MilliQ Advantage (美國Millipore公司); MS3 basic渦旋混合器(美國IKA公司); KQ-3200E超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司); 20孔固相萃取裝置(美國Waters公司)。

對位紅(純度>99.0%)、酸性橙Ⅱ(純度>98.6%)、蘇丹紅Ⅰ(純度>99.0%)和蘇丹紅Ⅱ(純度>99.0%)標準品均購于美國Sigma-Aldrich公司;甲醇、乙腈均為色譜級試劑,購自美國Thermo Fisher公司;甲酸、氨水、二氯甲烷等其他試劑均為分析純,購自鄭州三鑫化學試劑有限公司;3 cc規格的聚丙烯固相萃取小柱及配套的20 μm孔徑聚四氟乙烯(PTFE)篩板購自迪馬科技有限公司;研究過程中所使用的純水均經過Milli-Q純水系統純化;辣椒粉樣品購自鄭州各農貿市場。

PAF-6的合成方法參照本課題組之前的工作[30,31],由三聚氯氰和無水哌嗪在1,4-二氧六環(無水)溶液中回流反應得到。并用紅外光譜、掃描電鏡和固體核磁進行了表征,紅外譜圖1 300和1 491 cm-1處的吸收峰為哌嗪(-C-N-)和三聚氯氰(-C=N-)鍵的特征吸收峰;掃描電鏡圖中PAF-6納米粒子為層狀堆積,直徑大小約為200 nm;固體核磁譜圖中,在化學位移δ=44 ppm(10-6)處對應哌嗪環上sp3雜化的飽和碳原子的共振峰,在δ=166和169 ppm處對應三聚氯氰環上sp2雜化的不飽和碳原子的共振峰。上述數據與實驗室前期工作一致,證明PAF-6被成功制備。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液的配制:分別精確稱取10.00 mg對位紅、酸性橙Ⅱ、蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ標準品,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成質量濃度為100 mg/L的單標準儲備液。置于4 ℃冰箱中密封避光保存。

4種物質混合標準溶液的配制:分別移取1 mL上述4種單標準儲備液于10 mL容量瓶中,高純水定容至刻度,即得10 mg/L的混合標準儲備液,于4 ℃密封避光保存。

工作液的配制:將儲備液用流動相比例的溶液逐級稀釋至所需濃度。

1.3 樣品前處理

稱取2.0 g粉碎均勻的辣椒粉于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,超聲提取20 min后以5 000 r/min的速度離心5 min,取上清液,重復提取兩次,合并上清液。于40 ℃水浴下氮氣吹干,用10 mL 5%(體積分數,下同)的甲醇水溶液溶解,于4 ℃儲存待用[23]。

取10 mL上述樣品溶液,經過自制30 mg/3 mL PAF-6固相萃取小柱,進行富集凈化。PAF-6固相萃取小柱預處理過程:3 mL甲醇活化,3 mL水淋洗,上樣,5 mL水淋洗,3 mL 10%氨化乙腈洗脫。洗脫液于40 ℃水浴條件下用氮氣吹干,用1 mL流動相溶液復溶,經0.22 μm有機濾膜過濾,濾液供HPLC檢測。固相萃取流程見圖1。

圖 1 固相萃取流程Fig. 1 SPE process scheme PAF-6: porous aromatic framework-6.

表 1 主客體分子間吸附能量ΔEn

Note: DFT/B3LYP/6-31+G basis set from the Gaussian 09 program was used for model optimization and energy calculation.

1.4 色譜條件

色譜柱:Unitary C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:甲醇-0.2%甲酸水溶液(90∶10, v/v);紫外吸收波長:500 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL。

1.5 量子化學計算方法

基于密度泛函數理論(density functional theory, DFT),采用Gaussian 09程序DFT/B3LYP/6-31+G基組對主客體分子結構模型進行優化和能量計算[32]。

2 結果與討論

2.1 分子間作用機理考察

量子化學計算能夠直接和量化地描述PAF-6與目標分子之間化學吸附的作用力大小及種類,本文借助Gaussian 09程序的DFT/B3LYP/6-31+G基組進行模型優化和能量計算。在DFT算法下對PAF-6與目標物分子進行結構模型優化計算,其優化結果見圖2a～2e。模擬計算的吸附能如表1所示,計算公式如下:

ΔEn=EPAF-6-n-EPAF-6-En

(1)

其中ΔEn表示PAF-6與目標分子之間的吸附能,EPAF-6-n表示PAF-6與目標分子形成的超分子能量,EPAF-6表示PAF-6的能量,En表示目標分子能量。

從表1可知,主體分子PAF-6與目標分子之間的吸附能量都比較高,并且吸附是自發進行的,從而證明目標分子可以穩定地吸附在PAF-6分子中。由圖2可知,大多數目標分子被吸附在孔徑中,主要是主體分子PAF-6具有較大比表面積和孔徑結構,因此客體小分子可以穩定地吸附在PAF-6分子孔腔中。從模擬計算結果可知,PAF-6是一種混合模式吸附材料,可以提供π-π作用、氫鍵作用等多重作用力。因此,可以對偶氮類染料具有較強的吸附。

圖 2 (a)主體分子PAF-6及(b-e)主客體分子最優的構象Fig. 2 Most stable structures of (a) host PAF-6molecule and (b-e) host-guest molecule Using the DFT/B3LYP/6-31+G basis set from the Gaussian 09 program. Gray: carbon; white: hydrogen; red: oxygen; blue: nitrogen. Red circle: host-guest intermolecular interaction.

2.2 固相萃取條件的優化

本文對影響固相萃取效率的諸多因素進行了考察,包括吸附劑用量、洗脫劑種類、洗脫劑體積、樣品溶液pH等,以期找出PAF-6吸附劑在樣品基質中最大限度地對目標物進行富集凈化的條件。考慮到樣品基質的影響,固相萃取各個條件的優化均在樣品基質中進行,即在0.5 mg/L的添加水平下平行測定3次。

2.2.1PAF-6吸附劑用量

吸附劑用量是影響固相萃取效率的重要因素。合適的用量在保證柱容量的同時還可以節約實驗成本。所以本研究首先對PAF-6吸附劑的用量進行了探究,分別考察了吸附劑用量為10、20、30、40和60 mg時回收率的變化。結果見圖3a,隨著吸附劑用量的增加,4種物質的回收率均有升高,當用量超過30 mg后,各物質的回收率基本不再變化。因此最終選擇30 mg填料量的固相萃取小柱進行后續研究。

2.2.2洗脫劑種類

不同有機溶劑對4種偶氮類化合物的洗脫能力不同,因此有必要對洗脫劑種類進行優化,以達到較高的回收率。本研究選用甲醇、乙醇、乙腈和二氯甲烷作為洗脫劑進行試驗,但結果表明這4種有機溶劑對目標物的洗脫能力均較弱,回收率較低。后來向有機溶劑中加入少量氨水后進行試驗,回收率大大提高。這可能是由于在堿性條件下,目標物以分子狀態存在,PAF-6吸附劑與目標物之間的氫鍵作用力減弱,使目標物更容易洗脫下來。因此考察了5%氨化甲醇、5%氨化乙醇、5%氨化乙腈和5%氨化二氯甲烷對4種目標物的洗脫能力,結果見圖3b, 5%氨化乙腈對4種染料均有較好的洗脫效果,因此選用5%氨化乙腈為最佳洗脫劑。此外,還對乙腈中氨水含量對回收率的影響進行了考察,結果見圖3c。可以看出,當以10%氨化乙腈為洗脫劑時,4種物質的回收率達到最大,后來隨著乙腈中氨水含量的增加回收率反而有所下降,可能由于在偏堿性條件下,目標物與洗脫溶劑的作用減弱導致,因此后續研究均采用10%氨化乙腈為洗脫劑。

圖 3 (a)吸附劑用量、(b)不同種類體積分數為5%的氨化洗脫劑、(c)不同體積分數的氨化乙腈、(d)上樣速率、(e)洗脫劑體積、(f)樣品pH和(g)吸附劑重復使用次數對4種偶氮染料回收率的影響Fig. 3 Effects of different (a) amounts of sorbent, (b) types of 5% (volume percentage) ammoniation eluent, (c) volume percentages of ammoniated acetonitrile, (d) flow rates, (e) eluent volumes, (f) sample pHs and (g) sorbent reuse times on the recoveries of the four azo dyes

2.2.3上樣速率

為了在相對較短的時間內獲得較高的萃取效率,考察了上樣速率對4種偶氮染料萃取效率的影響,結果見圖3d。將樣品溶液分別以1.0、2.0、3.0、5.0和6.0 mL/min的上樣速率通過自制SPE小柱,在上樣速率為3.0 mL/min時,4種目標分析物的回收率達到最大,繼續增大上樣速率,目標分析物與萃取填料的接觸時間變短,萃取效率有所下降。因此,本研究以3.0 mL/min的速率上樣。

2.2.4洗脫劑用量

洗脫劑用量影響目標物從吸附劑上洗脫下來的程度。洗脫劑用量太少會使目標物洗脫不完全,用量太多不但會造成溶劑上的浪費,也會增加后續的工作量,因此本文考察了不同體積(1、2、3、5和7 mL)的洗脫劑對4種偶氮染料的洗脫情況。結果見圖3e,當洗脫劑體積達到3 mL時,4種目標物的回收率達到最大且后續沒有明顯的增加。綜合考慮實驗結果與實驗成本,最終選擇3 mL 10%氨化乙腈作為最佳洗脫劑用量。

2.2.5樣品溶液pH

樣品溶液pH決定了目標分析物在溶液中的存在狀態,狀態不同,其與PAF-6吸附劑之間的作用力也不同,從而影響到回收率的大小。因此對樣品溶液pH的探究具有十分重要的意義。本文考察了樣品溶液pH分別為2、4、6和8時回收率的變化情況。結果見圖3f,樣品溶液pH在4～6范圍內,4種目標物的回收率可達到85%以上,但在強酸或弱堿條件下回收率均較低,可能是由于在強酸條件下,多孔材料PAF-6本身的性質發生了變化,而在弱堿條件下,目標物以分子形式存在,與PAF-6之間的氫鍵作用力較弱,不利于吸附。因此,本研究最終選擇調節樣品溶液pH為4。

2.2.6材料重復利用性

為了能夠重復利用PAF-6吸附劑,減少實驗成本,本文還對材料的重復利用率進行了探究。將用過的固相萃取小柱經甲醇、乙腈、高純水凈化后再次用于樣品前處理過程。結果見圖3g,自制SPE小柱使用4次后回收率雖有所下降,但仍高于80%,說明多孔材料PAF-6對4種偶氮類化合物的吸附性能良好,且可以重復利用。為了保證實驗結果的精確性,最終選擇重復使用小柱兩次。

2.3 方法學考察

2.3.1檢出限、定量限和線性范圍

在上述最優條件下,以3倍信噪比(S/N=3)計算出4種偶氮染料的檢出限為1.5～7.0 μg/L,以10倍信噪比(S/N=10)計算出4種偶氮染料的定量限為5.0～22.1 μg/L。將4種偶氮染料的標準儲備液逐級稀釋,以4種偶氮染料的質量濃度(x, μg/L)為橫坐標、對應的峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。目標物在10～300 μg/L范圍內表現出良好的線性關系,相關系數(r)均大于0.999,結果見表2。

表 2 4種偶氮染料的回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

表 3 辣椒粉中4種偶氮類染料的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

2.3.2準確度與精密度

通過向空白樣品基質中加入低、中、高3個不同水平的4種目標物標準溶液進行加標回收試驗,以空白樣品基質加標的回收率表示方法的準確度,以同一天6份平行樣品測定結果的相對標準偏差作為日內精密度,以連續6天樣品測定結果的相對標準偏差作為日間精密度,以此來考察本方法的準確度與精密度,結果見表3。4種目標物的平均加標回收率為76.5%～89.8%,相對標準偏差(RSD)不大于5.3%(n=6),以上結果表明,本方法準確度與精密度良好,可以滿足辣椒粉樣品中對位紅、酸性橙Ⅱ、蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ4種偶氮類染料的檢測需求。

2.4 實際樣品測定

采用本文所建立的SPE-HPLC方法對24份辣椒粉樣品(樣品編號為1～24)中4種偶氮類化合物的含量進行了分析測定。結果(見圖4)顯示,僅在一份樣品(3號辣椒粉)中檢測出了目標物對位紅,含量為170.3 μg/kg。3號辣椒粉樣品經固相萃取處理后的色譜圖以及加標色譜圖見圖4。

2.5 方法對比

為了對本方法進行評價,將其與相關文獻方法進行了比較,結果見表4。通過對方法的樣品前處理技術、檢測手段、檢出限、精密度和回收率的比較顯示,本方法操作簡便,具有較低的檢出限、較好的重復性和較高的準確度。

表 4 本方法與相關文獻中方法的比較

DAD: diode array detector.

圖 4 (a)加標樣品和(b)空白樣品經SPE處理后4種偶氮染料的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the four azo dyes in the (a) blank and (b) spiked samples treated with SPE a. blank sample; b. sample spiked with 0.7 mg/L azo dyes. Conditions: column, Unitary C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase, methyl alcohol-0.2% (volume percentage) formic acid in water (90∶10, v/v); flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength, 500 nm; injection volume, 20 μL; column temperature, 30 ℃. Peak Nos.: 1. Para Red, 2. Sudan Ⅰ, 3. Sudan Ⅱ, 4. Orange Ⅱ sodium salt.

3 結論

本文基于PAF-6固相萃取吸附劑,建立了同時檢測辣椒粉中對位紅、酸性橙Ⅱ、蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ4種偶氮類染料的SPE-HPLC方法。在最優固相萃取實驗條件下,PAF-6吸附劑展現出了良好的富集凈化效果,在保證回收率的前提下可有效降低雜質對液相色譜分離的影響。該方法簡便、靈敏、準確,滿足實際樣品的檢測要求。