基于超高效液相色譜-八端口轉子閥的微升級預分級系統的建立

燕 蒙,趙 洋,張養軍,應萬濤*,錢小紅,*

(1. 廣東藥科大學藥學院, 廣東 廣州 510006; 2. 軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所,蛋白質組學國家重點實驗室, 北京蛋白質組研究中心, 國家蛋白質科學中心-北京, 北京 102206)

色譜和質譜技術的飛速發展,推動了復雜體系中蛋白質組成和動態變化的深度覆蓋鑒定與定量研究[1-3]。復雜生物樣本常常擁有具有高達10個數量級的濃度范圍,導致液相色譜的分離性能和質譜掃描的動態范圍難以在單次分析中充分識別樣品成分。因此在質譜分析前端,首先運用多維液相色譜系統進行預分離成為當前應對蛋白質組復雜性的重要解決方案。

多維液相色譜系統提供了高效的肽段分離方案,降低肽段的共洗脫,提高了峰容量,同時增加了針對復雜體系檢測的動態范圍,從而鑒定到更多數量的肽和蛋白質。其中,在線或離線二維液相色譜分離,在蛋白質組研究中被廣泛運用。二維色譜由常見的色譜分離方式組合而成,根據不同分離機理分為離子交換色譜、親水相互作用色譜、反相色譜等方法[4]。其中反相液相色譜(RPLC)具有分析速度快,分離效率高,而且流動相與質譜電噴霧電離(ESI)等電離技術相容,通常作為第二維分離模式。2005年,Gilar等[5]提出高pH反相色譜分餾作為第一維離線色譜分離,與第二維低pH反相液相色譜相結合。盡管兩個維度的分離都是基于肽的疏水性質,但pH對某些殘基的電荷狀態和側鏈疏水性的影響很大,因此也可達到很好的分離正交性。與其他方法相比,二維反相色譜在兩個維度上都具有非常高的肽分離效率[6,7]。但是從應用效果看,這兩個分離維度并不是完全正交的,分離組分間肽保留時間仍然存在一定相關性。為解決這一問題,在一維柱后引入“級聯”收集方式[8],將不同時間洗脫的餾分組合,使第二維液相色譜整個洗脫周期得到更有效利用,從而提高質譜鑒定的效率。

近年來,二維液相色譜和質譜相結合的定量方法越來越多地應用于復雜生物樣本或腫瘤組織等臨床樣本的深度定量蛋白質組分析[9-11]。常規高效液相色譜(HPLC)采用線性連續梯度洗脫模式,具有較高分離效率,而且能靈活改變級聯收集方案。但目前常規HPLC仍存在的限制是對初始樣本的大量需求和復雜的合并過程,以及由此帶來的肽段的吸附損失。基于相同反相色譜分離原理的Stage-Tip[12-14]方法,有效降低了對初始樣本的大量需求,并且減少了復雜實驗流程,是復雜肽段混合物預分離的有效工具。但是，StageTip方法只能采用階梯梯度洗脫,而且其預分離收集組分數目很難改變。鑒于以上2種方法,本文嘗試建立基于超高效液相色譜(UPLC)-八端口轉子閥的微升級預分級系統,使UPLC的高分辨率與八端口轉子閥自動化的組分分餾相結合,在基于色譜柱的液相色譜分離系統中,實現微克級初始樣本的超高效自動化預分離。通過與StageTip方法系統分析比較,UPLC-八端口轉子閥預分級顯示良好的肽段二維分離正交性和鑒定重復性。本研究為微量復雜生物樣本提供了一種高分辨率、高重復性的蛋白質組深度覆蓋策略。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q-Exactive HF臺式四極桿-軌道阱質譜儀、pH計、高速離心機購自美國Thermo Scientific公司;超高效液相色譜H-Class系統購自美國Waters公司;八端口轉子閥購自美國VICI公司;ACQUITY UPLC Peptide BEH C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm)購自美國Waters公司;超聲波破碎儀購自寧波新芝公司;真空濃縮蒸發儀購自德國Eppendorf公司;二氧化碳培養箱購自德國Thermo公司;超凈工作臺購自北京東聯哈爾儀器制造有限公司;-80 ℃超低溫冰箱購自日本Sanyo公司。

二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、氨水(NH3·H2O)、甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、尿素(urea)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均為分析純,乙腈為色譜純,購自美國Sigma公司;1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl購自中國Solarbio公司;蛋白酶抑制劑Cocktail購于瑞士Roche公司;牛血清白蛋白(BSA)、測序級胰蛋白酶購于美國Promega公司;DMEM細胞培養液、無菌磷酸緩沖液(PBS)均購自美國Hyclone公司;胎牛血清(FBS)、消化細胞用的0.05%(質量分數)胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液購自美國Gibco公司。HepG2細胞株購自美國模式培養物集存庫(ATCC),本實驗室保存。30 kDa超濾管購于美國Millipore公司;C8膜購于美國3M公司;C18填料購于中國天津博納艾杰爾公司;Tip槍頭購自Axygen公司(美國); C18脫鹽柱購于美國Waters公司。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1細胞全蛋白質提取

使用DMEM培養液培養人肝癌細胞HepG2,在37 ℃含5%(體積分數)二氧化碳及95%(體積分數)空氣飽和濕度溫箱中常規培養。使用0.05%(質量分數)胰酶-EDTA溶液消化收集細胞,離心去上清后,加入PBS溶液清洗。隨后加入0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl,重懸,加入等體積4%(質量(g)/體積(100 mL))SDS溶液、10 μL蛋白酶抑制劑。冰浴超聲裂解,超聲功率為180 W,超聲1 s,停頓2 s,共99個循環。將蛋白質樣本于4 ℃以20 000 r/min的速度離心10 min,取上清液,對蛋白質進行定量。分裝后存于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2蛋白質酶切

取500 μg HepG2細胞全蛋白質或BSA,加入8 mol/L尿素,將溶劑體系補足至500 μL,全部轉移至30 kDa超濾管,以20 000 r/min的速度離心20 min,以替換溶劑體系。在超濾管中加入100 μL 20 mmol/L DTT,在37 ℃恒溫箱還原反應4 h。取出超濾管,以20 000 r/min的速度離心15 min,加入100 μL 50 mmol/L IAA,在室溫暗處反應30 min。以20 000 r/min的速度離心15 min,加入100 μL 20 mmol/L DTT,在室溫暗處反應15 min。以20 000 r/min的速度離心15 min,加入200 μL 50 mmol/L碳酸氫銨,以20 000 r/min的速度離心15 min,此步驟重復一次。更換新套管,按照胰蛋白酶與蛋白質質量比為1∶50的比例加入20 μL 0.5 g/L胰蛋白酶,振蕩混勻,于37 ℃恒溫箱孵育過夜(>12 h),以20 000 r/min的速度離心15 min,回收液體,依次加入200 μL碳酸氫銨和超純水,以20 000 r/min的速度離心15 min,回收液體并合并,放入真空濃縮蒸發儀熱干,于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.3 UPLC-八端口轉子閥預分離

采用Waters超高效液相色譜H-Class系統,以Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C18色譜柱作為第一維分析柱,配在線過濾器。在高pH條件下進行液相色譜分離,流動相A為2%(體積分數,下同)乙腈-98%水,流動相B為98%乙腈-2%水,流動相A和流動相B均含0.1%氨水溶液,pH為10。流速為150 μL/min,柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序:0～24 min, 5%B～30%B; 24～26 min, 30%B～95%B; 26～29 min, 95%B; 29～30 min, 95%B～5%B; 30～33 min, 5%B。總梯度時長為33 min。每次運行結束后,回到初始狀態,重新平衡7 min后再上樣。在低pH條件下進行液相色譜分離,流動相A為2%乙腈-98%水,流動相B為98%乙腈-2%水,均含0.1%TFA溶液,pH為2。流速為150 μL/min,柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序:0～24 min, 5%B～30%B; 24～26 min, 30%B～95%B; 26～29 min, 95%B; 29～30 min, 95%B～5%B; 30～33 min, 5%B。總梯度時長為33 min。

色譜系統柱后連接八端口轉子閥,在3～28 min組分收集時間內,八端口轉子閥每隔60 s切換一次端口,將樣品肽段分為6組分和8組分。6組分收集方案中,第一個循環結束后,閥直接由第6個輸出端口轉換到第1個輸出端口,將新收集組分7合并到先前收集到的組分1中,以此類推,將樣品合并成6個組分。8組分收集方案中,第一個循環結束后,閥直接由第8個輸出端口轉換到第1個輸出端口,將新收集組分9合并到先前收集到的組分1中,以此類推,將樣品合并成8個組分。實驗上樣量均為50 μg HepG2細胞蛋白質提取液酶切肽段,由流動相A液溶解,進樣體積為10 μL。收集的組分用真空濃縮蒸干儀于45 ℃熱干。

1.4 StageTip預分離

將5 mg C18填料溶于90 μL甲醇,轉移至底部填有C8膜的Tip槍頭,用注射器推壓,壓緊C18填料,即得StageTip裝置。將90 μL乙腈加入裝置中,用注射器推壓,重復一次,推壓過后加滿乙腈,填柱完成,靜置活化填料2 h后使用。配置pH 10的氨水溶液,溶解HepG2細胞蛋白質酶切后的熱干肽段,渦旋振蕩,振蕩后測濃度。上樣前加入pH 10氨水平衡裝置柱,以1 500 r/min的速度離心7 min。上樣量為50 μg,用pH 10氨水稀釋至160 μL。將樣品分2次加入裝置中,以1 500 r/min的速度離心上樣,每次7 min。上樣完成后,將pH 10氨水加入裝置中脫鹽一次。配制6%(體積分數,下同)、9%、12%、15%、18%、21%、25%、30%、35%和50%乙腈-pH 10氨水10個洗脫梯度的洗脫液,每個梯度的洗脫液各取90 μL用于洗脫樣品。將6%、9%、12%、15%、18%和21%這6個梯度的洗脫液各用不同的Eppendorf管接收,再將25%梯度洗脫液合并到6%管中,30%洗脫液合并到9%管中,35%洗脫液合并到12%管,50%洗脫液合并到21%管。StageTip共分成6個組分。

1.5 第二維在線低pH HPLC-MS/MS

Q-Exactive HF臺式四極桿-軌道阱質譜儀分析樣本。使用自灌裝C18反相柱(120 mm×150 μm i. d.,填料粒徑1.9 μm),流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液。流速為600 nL/min,進樣體積為5 μL。洗脫梯度:梯度洗脫程序:0～71 min, 5%B～32%B; 71～72 min, 32%B～95%B; 72～78 min, 95%B。在使用Q-Exactive質譜儀進行分析時,一級質譜分辨率為120 000,掃描范圍為m/z300～1 400,選擇一級譜圖中豐度最強的20個離子進行二級分析,高能碰撞解離(HCD)高能碰撞能量為27%。二級質譜分辨率為15 000,掃描范圍為m/z200～2 000,最大注射時間為45 ms,自動增益控制(AGC)目標為5×104。

1.6 數據處理

質譜產生的數據使用Maxquant(版本1.5.3.8)軟件搜庫。以Swissprot收錄人蛋白質庫(20180518, 20 341條序列)為檢索數據庫。搜庫時設置最大漏切位點為2;固定修飾設置為Carboxyamidomethylation(C);可變修飾設置為Acetyl(ProteinN-term)、Oxidation(M);其他參數均為默認值。

2 結果與討論

2.1 八端口轉子閥

八端口轉子閥是具有1個輸入端口和8個固定輸出端口的流量選擇流出閥,轉子在程序設定的時間間隔,切換至不同輸出端口,每個輸出端口通過管線連接到不同收集管中進行樣品收集,一個循環結束后,閥轉換回第1個輸出端口,將新收集組分合并到先前收集到的組分中。以這種方式,裝置自動收集和級聯組分,不需要額外樣品收集管及收集組分的再混合。八端口轉子閥的原理如圖1a所示。控制軟件Vcom通過編程設定,不僅可以收集到8個輸出通道(A～H)的倍數,而且還可以按實驗方案收集到兩個或多個組分。八端口轉子閥全自動化操作,有效地避免了因人員操作和復雜試驗流程造成的誤差,有利于實驗的重復性和定量應用。八端口轉子閥通道內徑為0.4 mm,有效減少了柱后分離組分的再次混合,降低組分間重疊率,更有利于蛋白質及肽段的鑒定。

2.2 高效肽混合物預分級系統的建立

預分級系統主要由UPLC與八端口轉子閥組成,整個系統由轉子閥編程系統Vcom和液相操作軟件Empower 3控制,實驗流程見圖1b。其中UPLC包括液相四元泵、自動進樣室、柱溫箱。

圖 1 八端口轉子閥分餾原理及分餾實驗流程Fig. 1 Fractionation principle of the eight-port rotorvalve and its fractionation workflow a. Switch mechanism of the rotor valve, illustrating how the flow from the first dimension separation is divided into eight output lines (A-H); b. fractionation process based on the ultra-high performance liquid (UPLC) phase and the eight-port rotor valves.

以HepG2細胞蛋白質提取液酶切肽段為實驗樣品,UPLC采用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18柱作為第一維分離柱,在pH 10條件下,進行33 min梯度洗脫。新開啟色譜柱都需用BSA酶切肽段和HepG2細胞蛋白質提取液酶切肽段混合物進行鈍化,每次試驗前都使用BSA酶切肽段作為標準品,用于檢測色譜系統穩定性。

從超高壓第一維色譜柱上洗脫下的肽段,從柱后流入八端口轉子閥的輸入端口,在預定的時間間隔內,閥門切換到一個新的輸出端口,每個輸出端通過一個毛細管連接到收集裝置中的離心管中,將分離洗脫下的肽段進行收集。因為UPLC系統的流速為0.15 mL/min,每隔60 s切換一次端口,組分體積僅為150 μL,實現自動化高效分離的同時,有效降低了樣本較大組分體積造成的吸附損失。

2.3 UPLC-八端口轉子閥預分級系統第一維反相色譜分離表征

第一維高pH液相色譜條件下,經過八端口轉子閥分餾與級聯,按試驗方案收集8個組分(見圖2a),通過紫外檢測器,在相同高pH液相色譜條件下對每個組分重新上樣,觀察組分間的分離度(見圖2b),可見相鄰組分之間重疊度很低,而相間組分的紫外峰基本無重疊。

圖 2 預分離的級聯方案和反相液相色譜二維分離正交性Fig. 2 Fractionation concatenation strategy and orthogonality of separation between the two dimensions of RPLC a. UV (214 nm) chromatogram for pH 10 separation and the eight-fraction concatenation scheme; b. eight chromatograms (RP with pH 10) of the concatenated fractions (panel A) using separation conditions that identical to those in panel A; c. eight chromatograms (RP with pH 2) of the concatenated fractions. Nos. 3-28: the fractions collected from the 3 min to the 28 min at intervals of 1 min from the first-dimensional RPLC. F1-F8: the first fractionation to the eighth fractionation.

將在第一維高pH液相色譜條件下收集到的8組分熱干后,采用相同的液相色譜儀器和C18柱,在低pH條件下進行紫外檢測(見圖2c)。觀察到在33 min的低pH液相色譜洗脫梯度下,第一維高pH條件收集組分中的肽段都很好地分布于整個液相色譜的洗脫窗口,表明在不同pH值下的兩種反相液相色譜分離具有良好的正交性。

2.4 不同預分離方法鑒定結果比較

為了系統地比較微克級肽段混合物二維分離的效果,以HepG2細胞蛋白質提取液酶切肽段為實驗樣品,將第一維高pH條件下液相色譜洗脫餾分按6組分方案進行收集。同時采用常用的StageTip方法進行預分級。StageTip也是基于高pH反相色譜條件的預分級方法,使用人工操作進行階梯梯度洗脫分離及餾分匯合,分餾成6組分。兩種方法均使用50 μg相同的HepG2細胞蛋白質提取液酶切肽段進行試驗,使用相同質譜條件進行檢測,對其鑒定結果進行比較。結果如圖3所示,與StageTip方法相比,采用UPLC-八端口轉子閥的收集策略,各個組分之間的質譜峰呈現更為均勻的分布,提示更好的正交互補性。同時,鑒定肽段和圖譜數的分布也顯示UPLC-八端口轉子閥方法可以將肽段更均勻地分布于各個組分,提供更好的分辨率。

圖 3 UPLC-八端口轉子閥方法和StageTip方法收集級聯組分在相同質譜條件下的鑒定結果Fig. 3 Identification results of the concatenated fractions by the UPLC-eight-port rotor valve strategy and theStageTip strategy under the same mass spectrometry conditions a. base peak chromatograms of the concatenated fractions using the UPLC-eight-port rotor valve strategy; b. base peak chromatograms of the concatenated fractions using the StageTip strategy; c: comparison of separation methods according to the distribution number of peptides; d: comparison of separation methods according to the distribution number of spectra identified via MS/MS. Tip: StageTip strategy. UPLC-8: UPLC-eight-port rotor valve strategy.

表 1 根據總蛋白質數、獨特肽段、總肽段數、獨特肽段占總肽段數比例、平均序列覆蓋率對分離方法進行比較

6F: six fraction pools from the UPLC-eight-port rotor valve strategy. 8F: eight fraction pools from the UPLC-eight-port rotor valve strategy.

綜合考慮試驗時間和質譜鑒定工作量,優化UPLC-八端口轉子閥預分級方法收集方案,在相同條件下,采用8組分收集方案[15],分離后組分在相同條件下進行質譜檢測,結果見表1。與StageTip方法相比,在收集6個組分情況下,新建UPLC-八端口轉子閥方法中鑒定總蛋白質數、總肽段數、獨特肽段占比和平均序列覆蓋率都更高;與StageTip方法相比,新建UPLC-八端口轉子閥方法采用8組分接收方案,總蛋白質鑒定數提高7.49%,總肽段鑒定數提高23.52%,獨特肽段鑒定數提高23.91%,平均序列覆蓋率提高11.89%。由此可知,UPLC-八端口轉子閥預分離方法通過靈活的改變接收方案,提高二維分離正交性,對肽段進行高效的分離,進而實現對蛋白質的深度覆蓋鑒定。

圖 4 UPLC-八端口轉子閥方法的高重復性和穩定的分餾效率Fig. 4 High reproducibility and robust fractionation efficiency of the UPLC-eight-port rotor valve strategy a. the high overlap in the Venn diagrams of the quantified proteins from three replicates indicates good reproducibility of the eight fraction pools from the UPLC-eight-port rotor valve strategy; b. the high overlap in the Venn diagrams of the quantified proteins from three replicates indicates good reproducibility of the six fraction pools from the UPLC-eight-port rotor valve strategy; c. the high overlap in the Venn diagrams of the quantified proteins from three replicates indicates the reproducibility of the StageTip strategy; d. comparison of the intensity based on the absolute quantification (iBAQ) intensity for the three replicates suggests the highly accurate quantitative reproducibility of the eight fraction pools valve strategy.

2.5 UPLC-八端口轉子閥預分級方法的重現性

采用UPLC-八端口轉子閥預分級方法和StageTip預分級方法對HepG2肽段混合物進行鑒定,將3次重復試驗鑒定到的蛋白質數目占試驗鑒定總數目的比例作為重要依據,考察預分級方法重復性。如圖4所示,在UPLC-八端口轉子閥預分級方法中,采用8組分收集方案,3次試驗同時鑒定到6 978個蛋白質,占鑒定到的蛋白質的91.6%;采用6組分收集方案,3次試驗同時鑒定到6 470個蛋白質,占鑒定到的蛋白質的88.24%。在StageTip預分級方法中,3次試驗同時鑒定到6 376個蛋白質,占鑒定到的蛋白質的87.7%。此外,UPLC-八端口轉子閥預分級方法的技術重復之間的定量重現性也非常高(決定系數R2>0.95,見圖4d)。由此可知,UPLC-八端口轉子閥預分級方法提供了很好的定量重現性。

3 結論

在對蛋白質組進行深度和大規模表征的過程中,肽的預分級起著關鍵作用。本文基于UPLC和八端口轉子閥建立了新的RP-RPLC預分級方法,與StageTip系統比較表明,采用UPLC-八端口轉子閥預分離方法能顯著提高蛋白質、肽段的鑒定數目和方法的重復性,并且能夠針對不同的情況,靈活地改變接收方案,對肽段樣本進行精確鑒定。所建立的UPLC-八端口轉子閥預分離方法具有顯著的優點,有望在復雜生物樣本蛋白質組研究中對蛋白質進行高效分離和鑒定,進而實現對蛋白質組的深度覆蓋。