蒙藥壯西-21體外對胃癌細胞生長的影響

鄧秀玲 扈瑞平 李 薇 張建宇 武瑞兵 葉書梅 王海生

內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110

在我國胃癌的發病率居各種惡性腫瘤的第二位，其異質性強，預后較差。目前對于胃癌的治療主要采用手術、化療和放療三大手段，臨床上常用的化療和放療藥物，在殺傷腫瘤細胞的同時也給人體帶來不同程度地損傷或不良反應[1]。臨床實踐表明，蒙藥在抗腫瘤方面有一定的優勢，如藥理作用廣泛，不良反應小，不易產生耐藥性等[2]。

蒙藥壯西-21(以下簡稱壯西)是由寒水石等二十一味藥物組成的復方藥，臨床主要用于治療消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌等消化系統疾病[3-5]。壯西抗腫瘤作用主要來自臨床實踐中，雖然療效確切，但無進一步研究，特別是鮮見有從細胞、分子水平研究其作用機制的報道。本研究以體外培養的胃癌細胞為對象，觀察復方蒙藥壯西對胃癌細胞生長的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 蒙藥壯西(內蒙古國際蒙醫院)，用PBS配成50 mg/mL貯液，過濾除菌4 ℃保存備用，實驗時用培養液稀釋到所需濃度。胃癌MGC-803細胞(北京腫瘤研究所提供)，培養基DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(中國醫學科學院血液學研究所)，紫杉醇(四川太極制藥有限公司)，Hochest33342、碘化丙啶(PI)、塞唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(Sigama公司)。酶標儀(日本550型)，CO2恒溫孵育箱(美國NAPCO)，熒光顯微鏡(日本，NIKON)。

1.2 細胞培養 將胃癌MGC-803細胞置于含10%胎牛血清、80 u/mL慶大霉素的DMEM培養基中，培養于37℃含5%濕飽和CO2溫箱中，常規傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 細胞的活力實驗 MTT法，將培養的細胞調整濃度為3×104個/mL，接種于96孔板上，每孔0.2 mL，培養24 h，棄培養液，分別加入蒙藥壯西，使終濃度分別為：2.5、1.25、0.63、0.31、0.15 mg/mL。另設陰性對照組(不加藥)、空白對照組(無細胞和藥)、陽性對照組(紫杉醇處理組)其作用終濃度為10-6mol/L，各組設8個復孔。以上各組總體積均為200 μL。培養72 h，每孔加入20 μL 5%MTT，37 ℃溫育4 h，棄培養液加DMSO200 μL，振蕩10 min，酶標儀檢測570 nm處吸光度OD值。按公式計算細胞生長抑制率。

抑制率=(對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白組平均OD值)×100%

1.4 細胞形態觀察：壯西作用細胞48 h后，采用熒光雙染法觀察細胞形態變化。取1×106個細胞離心，經PBS洗滌2次，重懸于200 μL PBS中，分別加25 μL熒光染料Hoechst 33342和PI。37 ℃溫育8～10 min，離心洗滌后滴片，于熒光顯微鏡下觀察細胞形態改變。

2 結果

2.1 壯西對胃癌細胞的生長抑制作用 壯西對胃癌MGC-803細胞的增殖有一定的抑制作用，其生長抑制率隨濃度的增加而升高，呈現濃度依賴性趨勢。壯西對胃癌細胞生長的最高抑制率達84.87%，高于陽性對照組紫杉醇的抑制率，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 壯西對胃癌細胞的生長抑制

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 壯西對細胞形態的影響 倒置光顯微鏡下觀察到,正常培養的對照組細胞呈梭形貼壁生長，大小均勻，核圓居中，胞質清亮透明。2.5 mg/mL蒙藥處理組作用48 h后，部分細胞失去正常生長形態，細胞變小變圓，胞質亮度下降,胞膜皺縮、內陷；隨著時間推移，細胞形狀不規則，最后破碎壞死。熒光鏡下可見，對照組細胞被Hoechst 33342染色后，發出均勻的藍色熒光，大小一致,提示為正常活細胞；2.5 mg/mL處理組部分細胞的細胞核或細胞質內出現濃染致密的顆粒狀或塊狀熒光，提示為細胞染色質凝集、核固縮或核碎裂，為凋亡細胞的形態改變。此外，鏡下見壞死細胞被PI紅染。如圖1所示。

3 討論

細胞異常增殖和分化與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，腫瘤治療的一個基本問題是如何抑制腫瘤細胞的無限增殖能力。蒙藥壯西-21，漢名為寒水石二十一味散，由寒水石、蓽撥、訶子、石榴、瞿麥、沙棘、五靈脂、砂仁、紫花地丁、木鱉子、人工牛黃、連翹、木香、降香、麥冬等二十一味藥物組成,其藥理作用是調體內“赫依”“希拉”“巴達干”三根，具有保護消化道黏膜、抑制胃酸分泌的作用。組方中寒水石、蓽撥、五靈脂均具有抗腫瘤的作用[6]，但單體成分或提取物并不能反映蒙藥復方的廣泛藥理作用及蒙醫理論，而且蒙藥的臨床應用主要以復方制劑為主。為從細胞水平揭示蒙藥壯西的抗腫瘤作用，本實驗以體外培養的胃癌細胞為對象，觀察復方蒙藥壯西對胃癌細胞生長的影響。

MTT法是目前檢測藥物在體外對腫瘤細胞殺傷作用常用的方法之一，其原理是利用活細胞特別是增殖細胞內將MTT氧化為藍紫色甲臜晶體，沉積于細胞內，通過酶標儀檢測吸光度，了解細胞的存活情況，而死細胞則不能氧化MTT。本實驗通過MTT法觀察不同濃度的蒙藥壯西組對人胃癌細胞MGC-803生長的影響，結果表明壯西在體外能顯著抑制胃癌細胞的生長，尤以高濃度組的抑制率最高，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，呈現劑量依賴的趨勢。2.5 mg/mL藥物處理后對細胞的抑制率超過了紫杉醇組的抑制率。倒置光顯微鏡下見，蒙藥作用后細胞形態發生明顯的改變。采用熒光雙染法對胃癌細胞的形態學變化進行進一步觀察,發現胃癌細胞經壯西作用后，部分細胞核凝集、碎裂成片狀，呈凋亡細胞的形態改變，還有部分細胞趨向壞死的改變，表明該藥在體外對胃癌細胞發揮生長抑制作用的機制之一，可能是誘導細胞凋亡。組方中的主藥寒水石在蒙醫中有不同的炮制方法，可用于治療不同的病癥[7]。其中寒水石與與訶子、硼砂、光明鹽、蓽茇、麥冬組成灰化小劑，趙立遠等[8]研究發現該化灰小劑可抑制S-180荷瘤小鼠的腫瘤的生長，其作用機制可能是通過調節免疫，調控凋亡相關蛋白的表達有關。本實驗也初步觀察到了壯西有誘導細胞凋亡的作用。本實驗僅觀察了蒙藥對胃癌細胞殺傷的生物學效應，其具體的作用機理尚需深入研究。