仙茅多糖對小鼠巨噬細胞吞噬活性的影響

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550025

多糖是一類存在于動植物和微生物中的天然高分子化合物，具有重要的生物功能和寶貴的藥用價值[1]。研究認為植物多糖普遍具有調節機體免疫功能的活性，尤其對機體非特異性免疫系統的調節效應比較顯著[2-4]。仙茅(CurculigoorchioidesGaertn)是石蒜科多年生草本植物，其藥用部位為根莖，其性溫，入腎，肝經，主要功效有補腎助陽、益精血、強筋骨和行血消腫，主要用于腎陽不足、虛勞內傷和筋骨疼痛等病癥[5]，仙茅多糖(Curculigoorchioidespolysaccharide，COP)是仙茅的水提醇沉部分，課題組前期研究發現仙茅多糖能調節小鼠免疫功能，也能通過增加小鼠巨噬細胞株RAW264.7分泌活性因子TNF-α和NO，促進巨噬細胞的活化[6-7]。巨噬細胞是機體內重要的非特異性免疫細胞，具有吞噬、清除病原體的，同時巨噬細胞也是許多多糖的主要作用靶細胞[8-9]。因此本實驗擬將仙茅多糖分別作用于小鼠巨噬細胞株RAW264.7和小鼠腹腔原代巨噬細胞，探討仙茅多糖對小鼠巨噬細胞吞噬活性的影響。

1 材料與儀器

1.1 動物 SPF級昆明種小鼠，雌性(雌性小鼠與雄性小鼠腹腔巨噬細胞的非特異性免疫功能沒有差異)，2月齡，體質量為18～22 g，購自長沙天勤動物實驗中心，合格證號：SCXK(湘)2014-001，飼養于實驗室獨立送風飼養籠具中。

1.2 細胞株 小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫(編號：KCB200603YJ)。

1.3 試劑 仙茅藥材購買于貴陽市萬東橋藥材市場，經貴陽中醫學院孫慶文教授鑒定為仙茅CurculigoorchioidesGaertn的根；熒光標記大腸桿菌(V6694)購買于美國BD公司；DAPI溶液(C0065)、抗熒光衰減封片劑(S2100)購買自北京索萊寶科技有限公司。營養肉湯培養基(070912)購買于上海中科昆蟲生物技術開發有限公司。

1.4 儀器 CO2培養箱(New Brunswick Galaxy 170s)，熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS U-RFL-T),生物安全柜(Haier HR60-HA2)。

2 方法

2.1 仙茅多糖的制備及濃度配置 參照文獻[10]制備仙茅多糖，仙茅根塊曬干粉碎后用75%～80%的乙醇脫脂處理后風干打粉。稱取5 g干粉溶解于175 mL蒸餾水中，于95℃水浴加熱提取150 min。抽濾并收集濾液，殘渣按上述方法重復提取2次。濾液合并，減壓濃縮至一定體積后，加入終體積分數不低于80%食用酒精沉淀。抽濾后沉淀物分別用90%酒精和丙酮洗滌，真空干燥后采用苯酚法測定其中多糖的含量為50%。仙茅多糖用無血清DMEM培養基中配制成濃度為500 μg/mL的母液，濾菌后4 ℃保存，實驗時用DMEM 培養基稀釋即得。

2.2 RAW264.7細胞培養 用含10%胎牛血清DMEM培養基(含青霉素1×105U/L、鏈霉素1×105U/L，pH7.2～7.4)置于5%CO2、37 ℃條件下培養。細胞傳至第3代，通過細胞形態學觀察，3～6代細胞用于實驗。

2.3 小鼠腹腔原代巨噬細胞提取 參照文獻[11-12]提取小鼠腹腔原代巨噬細胞，實驗前3天給小鼠腹腔注射5%淀粉營養肉湯，每只小鼠注射1 mL、每天注射1次。干預結束后，小鼠脫頸處死并用75%酒精消毒，在無菌條件下，充分暴露小鼠腹部肌層，腹腔注入10 mL含雙抗的DMEM培養基，輕揉腹部5 min，然后吸取小鼠腹腔細胞懸液，移入離心管中，離心3000 r/min,5 min,用預冷PBS洗2次；得到細胞接種于24孔板，每孔接種細胞106個，共18孔，培養4 h細胞貼壁，用預冷PBS洗2次，即得小鼠腹腔原代巨噬細胞。

2.4 細胞培養及處理 將RAW264.7細胞和小鼠腹腔原代巨噬細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁后，吸棄上清，分別加入含不同濃度仙茅多糖的DMEM培養基，使仙茅多糖濃度為500，250，125，62.5，31.25，0 μg/mL，每組設3個平行孔，分別刺激36 h。

2.5 巨噬細胞吞噬熒光標記大腸桿菌 培養結束后，吸棄上清，預冷PBS洗2次，加入以雙蒸水200倍稀釋的熒光標記大腸桿菌溶液(1mL/孔)，室溫避光孵育1.5 h。干預結束后，吸棄上清，臺盼藍染色5 min，PBS洗5次，每次3 min，加入4%多聚甲醛固定細胞。最后以DAPI染核5Smin，取出爬片蓋于載玻片上，滴加抗熒光衰減封片劑并封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察。

2.6 巨噬細胞吞噬百分率 玻片于熒光倒置顯微鏡下觀察200個細胞，記錄吞噬熒光標記大腸桿菌的巨噬細胞數量；吞噬百分率(PP%)=200個巨噬細胞內吞噬熒光標記大腸桿菌的巨噬細胞數量/200個細胞巨噬細胞總數×100%。

2.7 統計學分析 應用SPSS16.0 軟件進行統計學分析，組間采用單因素方差分析進行顯著性檢驗，以P<0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 仙茅多糖對RAW264.7細胞吞噬作用的影響 如圖1所示，各組RAW264.7細胞吞噬熒光標記大腸桿菌后，細胞形態輪廓清晰，形狀呈圓形或橢圓形。正常對照組明顯可見RAW264.7細胞有吞噬熒光標記大腸桿菌；與正常對照組比較，仙茅多糖組細胞吞噬熒光標記大腸桿菌明顯較多。表1所示，仙茅多糖組細胞吞噬百分率都比正常對照組細胞吞噬百分率顯著性增高(P<0.01)，仙茅多糖在濃度為31.25～500 μg /mL范圍內能增強RAW264.7細胞吞噬能力，且呈現出良好的量效關系。提示仙茅多糖能增強RAW264.7細胞的吞噬功能。

3.2 仙茅多糖對小鼠腹腔原代巨噬細胞吞噬作用的影響 如圖2所示，小鼠腹腔原代巨噬細胞吞噬熒光標記大腸桿菌后，細胞形態輪廓清晰，形狀呈圓形或橢圓形。正常對照組明顯可見小鼠腹腔原代巨噬細胞有吞噬熒光標記大腸桿菌；與正常對照組比較，仙茅多糖組細胞吞噬熒光標記大腸桿菌明顯較多。表2所示，仙茅多糖125～500 μg/mL組細胞吞噬百分率都比正常對照組吞噬百分率顯著性增高(P<0.05或P<0.01)，仙茅多糖在濃度為125～500 μg/mL范圍內可以增強小鼠腹腔原代巨噬細胞吞噬熒光標記大腸桿菌的能力，且呈現出較好的量效關系。提示仙茅多糖能增強小鼠腹腔原代巨噬細胞的吞噬功能。

表1 仙茅多糖對RAW264.7細胞吞噬百分率的影響

表2 仙茅多糖對小鼠原代腹腔巨噬細胞吞噬百分率的影響

4 討論

巨噬細胞在正常機體的免疫防御過程中扮演著重要的角色，參與機體抗感染、抗腫瘤、免疫調節等過程，是機體非特異性免疫防御的關鍵環節。由于小鼠和人具有同源性，許多學者以小鼠來源的巨噬細胞作為細胞模型研究人類巨噬細胞生理、病理免疫反應。研究表明不同來源的巨噬細胞在復雜微環境中，其細胞形態、功能、表型會產生一系列復雜的變化[10]。所以，體外研究不同來源的小鼠巨噬細胞對了解人體巨噬細胞免疫反應(如吞噬、細胞因子分泌)具有重要意義。小鼠腹腔原代巨噬細胞是通過無菌性炎癥刺激獲取的，此細胞很好地保留了外周巨噬細胞的許多生理學特性，是比較接近生理狀態的巨噬細胞。巨噬細胞株RAW264.7細胞源自Abelson鼠科的腹腔巨噬細胞，是一種白血病病毒誘導的腫瘤細胞，其生理狀態、某些基因或細胞因子表達(其sIg-, Ia-、Thy1.2-表面抗原陰性)發生了改變，采用此細胞不可避免的會影響實驗結果的準確性。因此，本實驗采用不同來源的小鼠巨噬細胞，以求更準確的探討仙茅多糖對巨噬細胞吞噬活性的影響。結果表明，仙茅多糖能增強這兩種不同來源的小鼠巨噬細胞的吞噬功能，并且呈劑量依賴性增強小鼠巨噬細胞的吞噬功能。