苗藥阿銳布對四氯化碳致小鼠急性腎損傷的保護作用

黔南民族醫學高等專科學校,貴州 都勻 558013

四氯化碳在生產和使用環節中易引起環境污染，中毒時有發生，腎中毒時主要表現為急性壞死性腎病。貴州苗藥阿銳布為玄參科腹水草屬寬葉腹水草Veronicastrumlatifolium(Hemsl.)Yamazaki的全草，具有清熱解毒、行水散瘀、活血化瘀的功效[1]，治療急慢性腎炎療效顯著[2]，在苗族民間主要用于治療肝炎、水腫、肝硬化腹水、急性腎炎、跌打損傷等[3]，但未見其對腎損傷的保護作用研究報道。本實驗采用皮下注射四氯化碳構建小鼠腎損傷模型，初步探討苗族藥阿銳布對小鼠腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 50只昆明種小鼠購自第三軍醫大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(渝)2017-0002，雌雄各半，體重(20.2±2.1)g。樣本藥材購置貴州省益康中藥堂，經本校中藥教研室李香副教授鑒定為玄參科腹水草屬Veronicastrum.latifolium(Hemsl.)yamazaki。稱取500 g阿銳布的干燥全草粉碎，加蒸餾水2500 mL煎煮3 h，濾過；再加蒸餾水2000 mL煎煮2 h，濾過，合并兩次濾液，濃縮至一定程度后，加蒸餾水定容至1000 mL容量瓶中，得質量濃度為0.2 g·mL-1(按原藥材量計)的阿銳布水提液，冷藏備用。CCl4購自北京化工廠，批號20131029；ALT、AST、MDA、SOD等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20180520、20180522、20180517、20180518；聯苯雙酯購自廣州白云山星群藥業股份有限公司，批號H44023176。

1.2 分組與給藥 將50只小鼠按每組10只隨機平均分為正常組、模型組、及阿銳布低、中、高劑量組。各組每天灌胃給藥1次，連續14 d。阿銳布低、中、高劑量組分別灌胃100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、400 mg·kg-1，正常組和模型組以0.9%生理鹽水灌胃。除正常組外，余各組小鼠末次給藥后2 h，以0.02 mL·g-1腹腔注射0.4% CCl4花生油溶液，16 h后稱體重，摘眼球取血；后處死小鼠，取出腎臟，肉眼觀察顏色及形態變化。

1.3 儀器 SM-3型酶標儀(北京天石科技有限責任公司)，7070型全自動生化分析儀(日本日立公司)；FA2004型電子天平(上海津平科學儀器有限公司)；7230G型可見分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)；LDZ-52型離心機(北京離心機廠)；生物組織切片機(LEICA RM2235,LEICA公司,德國)；光學顯微鏡(OLYMPUS BX50,OLYM-PUS 公司,日本)。

1.4 觀察指標及測定

1.4.1 腎系數的測定 處死小鼠后，取兩側全腎，濾紙吸干腎表面血液后稱重。計算腎系數。

腎系數=兩側腎質量(g)/體質量(kg)×100%。

1.4.2 脂質過氧化指標的測定 取部分腎皮質，每樣本加1 mL預冷的生理鹽水，冰水浴中勻漿，于4 ℃，3000/min 離心15 min，取上清檢測。按照試劑盒提供的方法測定MDA含量及SOD活性。

1.5 病理切片分析 取一小塊(10 mm×5 mm)腎臟組織，經固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE法染色，鏡下觀察各組腎臟組織病理變化。

2 結果

2.1 一般情況 正常組大鼠皮毛光滑密澤，大便正常，進食無異常；模型組大鼠出現精神萎靡、食量減少、血尿等；而阿銳布各組組小鼠的精神狀況明顯好轉，血尿情況很大程度得以減輕。

2.2 各組小鼠腎系數測定結果 與模型組比較，空白組及高劑量組腎臟指數明顯升高(P﹤0.05或P﹤0.01)。見表1。

表1 阿銳布對CCl4致腎損傷小鼠腎臟指數的影響

注：與模型組相比aP﹤0.05，bP﹤0.01。

2.3 各組小鼠脂質過氧化指標的測定 與模型組比較，阿銳布中、高劑量組MDA含量明顯降低(P﹤0.01)；阿銳布中、劑量高組SOD含量升高明顯(P<0.05或 <0.01)，表明中、高劑量的阿銳布具有較強的抗氧化作用。見表2。

表2 各組小鼠腎組織MDA、SOD的結果

注：與模型組相比,aP﹤0.01；bP﹤0.05;cP﹤0.01。

2.4 腎組織形態學觀察 正常組腎小球及腎小管形態結構無異常(A)；模型組(B)腎組織間質血管擴張，充血，水腫，部分近端小管管壁上皮細胞濁腫明顯伴空泡變性，管腔狹小，部分近端小管管壁上皮細胞萎縮，管腔擴張，腔內見紅細胞管型尿，腎小球出血、少數壞死；阿銳布低劑量組(C)與模型組比較，病變稍有減輕,但無明顯變化；阿銳布中劑量組(D)腎小球結構清晰，大小、數量正常，間質輕度水腫及少量小管管壁上皮細胞空泡變性；阿銳布高劑量組(E)腎小球及腎小管形態結構接近正常。如圖1所示。

3 討論

已有研究表明, CCl4在體內代謝后能夠形成自由基, 引起脂質過氧化并導致組織器官結構和功能的破壞[4]。貴州苗藥阿銳布為玄參科腹水草屬寬葉腹水草的全草，具有清熱解毒，行水散瘀，活血化瘀的功效[1]，治療急慢性腎炎療效顯著[2]；但未見其對腎損傷的保護作用研究報道。本實驗參照 KOICHIRO SUZUKI 等的實驗方法建立 CCl4誘導小鼠急性腎損傷模[5]，初步探討苗族藥阿銳布對實驗小鼠腎臟的保護作用。

腎的近端小管上皮細胞含有高濃度的微粒體酶，具有氧化外來化合物的作用[6]，而且機體大部分有機物質的清除在近端小管完成，因此該部位細胞易受外界因素的影響；CCl4作用于肝臟中產生的自由基，通過血液進入腎臟，并攻擊腎小管、腎小球細胞膜上的磷脂分子，引起脂質過氧化反應，進而發生急性腎損傷[7]，并產生大量的MDA，可嚴重破壞細胞膜結構，致細胞腫脹、壞死[8]；實驗中，模型組腎組織間質血管擴張，充血，水腫，部分近端小管管壁上皮細胞濁腫明顯伴空泡變性，管腔狹小，部分近端小管管壁上皮細胞萎縮，管腔擴張，腔內見紅細胞管型尿，腎小球出血、少數壞死，以上觀察到的病理改變與CCl4致腎臟結構破壞表現相一致，且模型組較空白組腎臟指數明顯降低(P<0.01)，提示注射四氯化碳構建小鼠腎損傷模型造模成功；SOD是體內重要的抗氧化酶，能起到清除自由基、抑制脂質過氧化反應的作用，還能夠反應機體的抗氧化能力[9]；周伯旭等[10]從腹水草中分離出3-4二甲異阿魏酸。阿魏酸具有清除氧自由基、過氧化亞基、亞硝酸鹽、增加免疫功能、抗血小板凝集、抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變等廣泛的藥理作用[11]。本研究中，模型組與正常組比較，MDA含量明顯升高(P﹤0.01)，SOD含量明顯降低(P﹤0.01)，提示模型組細胞內活性氧成分積累過度，細胞嚴重受損。給予不同劑量阿銳布后，MDA表達水平下降，SOD含量明顯升高(P﹤0.01)，同時鏡下腎組織形態學表現逐步好轉，提示不同劑量阿銳布可能通過清除實驗小鼠氧自由基和過氧化亞基，通過抗氧化作用保護腎損傷。尤其阿銳布高劑量組腎臟指數(P<0.05)明顯升高及高劑量組光鏡下形態學改變較模型組明顯得到改善，表明高劑量的阿銳布對四氯化碳致小鼠腎損傷有較好的保護作用。

綜上所述，苗藥阿銳布對腎損傷具有治療性作用，可能與其所含阿魏酸的異構體3-4二甲異阿魏酸能清除氧自由基和過氧化亞基而產生的抗氧化作用機制有關。但關于阿銳布減輕腎損傷的具體機制仍有待進一步研究。