熒光定量PCR法用于診斷肺結(jié)核患者痰液中結(jié)核分枝桿菌DNA的臨床價(jià)值

謝景齊 周嬌紅

[摘要]目的 探討熒光定量PCR法用于診斷肺結(jié)核患者痰液中結(jié)核分枝桿菌（TB）DNA的臨床價(jià)值。方法 選取2017年7～11月我院收治的25例肺結(jié)核或陳舊性結(jié)核的患者，并選擇同期的25例非結(jié)核病呼吸道感染患者。采用熒光定量PCR法、抗酸染色法及培養(yǎng)法檢測(cè)受檢人員痰液的TB，并對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性率及患者滿意度進(jìn)行觀察及評(píng)估。結(jié)果 熒光定量PCR法檢測(cè)肺結(jié)核或陳舊性結(jié)核患者的陽(yáng)性率高于抗酸染色法與培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；熒光定量PCR法的敏感性高于抗酸染色法與培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；熒光定量PCR法、抗酸染色法及培養(yǎng)法三種方法的特異性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；熒光定量PCR法的總滿意度高于抗酸染色法與培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 熒光定量PCR、抗酸染色法及培養(yǎng)法用于診斷肺結(jié)核患者中均具有較高的臨床價(jià)值，但熒光定量PCR法優(yōu)勢(shì)更大，具有操作簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)勢(shì)，能夠?yàn)榧膊≡缙谠\斷及預(yù)防提供有效參考依據(jù)，值得應(yīng)用及推廣。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核分枝桿菌；痰涂片；肺結(jié)核；診斷

[中圖分類(lèi)號(hào)] R521 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）4（c）-0150-04

Clinical value of real-time PCR in diagnosis of Mycobacterium tuberculosis DNA in sputum of patients with pulmonary tuberculosis

XIE Jing-qi ZHOU Jiao-hong

Department of Clinical Laboratory， Chen Xinghai Hospital of Zhongshan City in Guangdong Province， Zhongshan 528415， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical value of real-time PCR in diagnosis of Mycobacterium tuberculosis （TB） DNA in sputum of patients with pulmonary tuberculosis. Methods Twenty-five patients with tuberculosis or old tuberculosis were enrolled from July to November 2017. Twenty-five healthy subjects were selected as subjects during the same period. Real-time PCR， the acid-fast staining method and the culture method were used to detect the TB of the examinee， and the positive rate of detection and patient satisfaction were observed and evaluated. Results The positive rate in detection of tuberculosis or obsolete tuberculosis of real-time PCR was higher than that of acid-fast staining and culture method， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The sensitivity of real-time PCR was higher than that of acid-fast staining and culture method， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference among the quantitative PCR， acid-fast staining and culture method in the specificity （P>0.05）. The total satisfaction of the real-time PCR method was higher than that of the acid-fast staining method and the culture method， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Real-time PCR， acid-fast staining and culture methods have high clinical value in the diagnosis of tuberculosis patients， but the quantitative PCR method has the advantages of greater operation， simple and fast operation， and can provide early diagnosis and prevention of diseases， which is worthy of application and promotion.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Sputum smear； Tuberculosis； Diagnosis

肺結(jié)核是臨床上較為常見(jiàn)的疾病之一，發(fā)病率呈日益上升趨勢(shì)，若不早期進(jìn)行有效診斷及治療會(huì)給患者的身體健康造成嚴(yán)重影響，目前臨床上診斷該病手段較多，其中最為常用方法之一在于抗酸染色法，具有操作簡(jiǎn)單、方便等優(yōu)勢(shì)，但是于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可受涂片、染色誤差的影響進(jìn)一步降低檢測(cè)敏感性。臨床上將痰培養(yǎng)方法作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，具有極高的確診率，但是培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可在一定程度上耽誤患者的最佳治療時(shí)機(jī)，且讓病情進(jìn)一步加重，與此同時(shí)存在假陽(yáng)性率及假陰性率。而熒光定量PCR法具有確診率高、操作簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)勢(shì)，廣受醫(yī)生及患者青睞[1]。本研究旨在探討熒光定量PCR法用于診斷肺結(jié)核患者痰液中結(jié)核分枝桿菌（TB）DNA的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年7～11月我院收治的25例肺結(jié)核或陳舊性結(jié)核的患者，其中男12例，女13例；年齡25～70歲，平均（47.52±1.13）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)相關(guān)檢查確診[2]；②存在盜汗、咳嗽、咯血、潮熱等一系列臨床表現(xiàn)；③存在消瘦、貧血、肺部濕羅音等體征；④經(jīng)X線檢查發(fā)現(xiàn)肺部組織存在空洞、鈣化、浸潤(rùn)等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①于入院治療前存在嚴(yán)重肝腎疾病；②存在惡性腫瘤等疾病；③存在宮頸癌等疾病；④合并艾滋病及梅毒等傳染性疾病；⑤存在嚴(yán)重心力衰竭等疾病；⑥存在嚴(yán)重過(guò)敏史及藥物禁忌證等[3]。另選擇同期的25例非結(jié)核病呼吸道感染患者。所有患者均認(rèn)知功能正常，同意參加本研究并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

采用熒光定量PCR法、抗酸染色法及培養(yǎng)法檢測(cè)受檢人員的TB，并對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行觀察及評(píng)估。囑咐患者于次日早、中、晚漱口后深咳，以便于取出痰液，裝入一次性痰液杯中，加蓋送檢，采集標(biāo)本過(guò)程中需格外注意其他痰液混入其中，以免影響實(shí)驗(yàn)室結(jié)果。

抗酸染色法：取痰液標(biāo)本涂抹于載玻片上，隨后對(duì)標(biāo)本進(jìn)行萋-尼氏抗酸桿染色處理，待染色完畢后，采用顯微鏡對(duì)載玻片進(jìn)行檢查，且在顯微鏡下按照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃-痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》所規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告結(jié)果計(jì)數(shù)。

熒光定量PCR法：采用PCR方法檢測(cè)TB，于痰液樣本中加入2～3倍樣本體積的4%NaOH溶液振蕩混勻，靜置液化30 min，取500 μl液化后的樣本置于離心管（1.5 ml），12000 r/min，離心3 min，吸除上清；隨后加入1 ml無(wú)菌生理鹽水重懸沉淀12000 r/min，離心3 min，吸除上清，再加入50 μl核酸釋放劑蓋上管蓋，100℃處理10 min，12000 r/min離心3 min，上清作為待測(cè)樣本，且加入處理后的待測(cè)樣本（5 μl）和40 μl PCR-mix置入PCR反應(yīng)管，上機(jī)檢測(cè)。

痰培養(yǎng)法：采用酸性改良羅氏培養(yǎng)基對(duì)TB進(jìn)行培養(yǎng)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①觀察并評(píng)估受檢人員的檢測(cè)陽(yáng)性率及患者滿意度。滿意度采用問(wèn)卷調(diào)查表評(píng)估，分為3個(gè)等級(jí)，總分值0～100分，80～100分為一級(jí)滿意，60～<80分為二級(jí)滿意，<60分為三級(jí)滿意，總滿意度=（一級(jí)滿意+二級(jí)滿意）/總例數(shù)×100%。②比較三種檢查方法的敏感性及特異性。敏感性=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性+假陰性）例數(shù)×100%；特異性=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽(yáng)性）例數(shù)×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1三種方法檢測(cè)肺結(jié)核或陳舊性結(jié)核患者陽(yáng)性率的比較

熒光定量PCR法檢測(cè)肺結(jié)核或陳舊性結(jié)核患者的陽(yáng)性率高于抗酸染色法與培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；抗酸染色法與培養(yǎng)法檢測(cè)肺結(jié)核或陳舊性結(jié)核患者的陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2三種檢測(cè)方法敏感性、特異性的比較

熒光定量PCR法的敏感性高于抗酸染色法與培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；抗酸染色法與培養(yǎng)法的敏感性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；熒光定量PCR法、抗酸染色法及培養(yǎng)法三種方法的特異性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.3肺結(jié)核或陳舊性結(jié)核患者滿意度的比較

熒光定量PCR法的總滿意度高于抗酸染色法與培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；抗酸染色法與培養(yǎng)法的總滿意度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

3討論

肺結(jié)核是臨床上較為常見(jiàn)疾病之一，主要是由TB感染所引起，能夠累及全身多系統(tǒng)、多器官，具有極高的發(fā)病率及死亡率，同時(shí)也是一種人畜共患傳染病，若不及時(shí)進(jìn)行早期診斷及治療，任其發(fā)展，可對(duì)患者身體健康造成嚴(yán)重威脅；該病在臨床上具有多樣化特點(diǎn)，早期無(wú)明顯臨床癥狀，可起病初期發(fā)生食欲減退等癥狀，且持續(xù)數(shù)周的發(fā)熱，與此同時(shí)患者可伴有精神不振、消瘦、乏力及手足心潮熱等表現(xiàn)[4-6]。目前在臨床上通過(guò)檢測(cè)痰液中的TB判斷患者是否存在肺結(jié)核疾病，檢測(cè)方法包括三種，即PCR法、抗酸染色法及培養(yǎng)法；其中以培養(yǎng)法作為臨床上金標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)也會(huì)選擇采用胸部X線片檢查，但是診斷效果令人不滿意，即無(wú)法確診肺結(jié)核，且容易發(fā)生誤診及漏診事件，主要是因?yàn)榉窝住⒎尾磕[瘤等疾病均存在肺結(jié)核相似的X線片影像，因此臨床上通常選擇以上三種方法檢測(cè)痰液中細(xì)菌，同時(shí)也是診斷肺結(jié)核唯一指標(biāo)[7-9]。抗酸染色法在臨床上得到廣泛應(yīng)用及推廣，具有操作簡(jiǎn)單、方便等優(yōu)勢(shì)，但是能夠在一定程度上受操作者的主觀性影響，繼而降低檢測(cè)的敏感性；而痰培養(yǎng)技術(shù)具有較高的診斷確診率，主要是通過(guò)專(zhuān)門(mén)的培養(yǎng)皿，于合適的外界環(huán)境中培訓(xùn)菌群，即遵守致病菌高于污染菌原理，但其培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，同時(shí)存在一定假陽(yáng)性率及假陰性率，且實(shí)驗(yàn)操作較為復(fù)雜[10]。也有學(xué)者建議選擇PPD試驗(yàn)方法，主要是通過(guò)致病菌，讓機(jī)體產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞，繼而與致病菌再次接觸發(fā)生反應(yīng)，可在皮膚表面直接表達(dá)，具有操作快捷等優(yōu)勢(shì)，但是經(jīng)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)敏感性及特異性較低，僅能作為輔助臨床診斷手段[11-12]。

熒光定量PCR法在臨床上得到廣泛應(yīng)用及推廣，主要是通過(guò)對(duì)PCB循環(huán)產(chǎn)物的檢測(cè)，繼而進(jìn)行定量分析，具有操作簡(jiǎn)單、方便、敏感度高、特異性高等優(yōu)勢(shì)[13-15]。本研究結(jié)顯示，熒光定量PCR法檢測(cè)肺結(jié)核或陳舊性結(jié)核患者的陽(yáng)性率高于抗酸染色法與培養(yǎng)法的陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。抗酸染色法陽(yáng)性率較低的主要原因在于痰液中TB分布不均勻，導(dǎo)致觀察數(shù)量受限，因此選擇熒光定量PCR法測(cè)定TB的意義重大，可在早期疾病診斷及預(yù)防中提供可靠指導(dǎo)依據(jù)。

綜上所述，熒光定量PCR法、抗酸染色法及培養(yǎng)法用于診斷肺結(jié)核患者中均具有較高的臨床價(jià)值，但熒光定量PCR法優(yōu)勢(shì)更大，具有操作簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)勢(shì)，能夠?yàn)榧膊≡缙谠\斷及預(yù)防提供有效參考依據(jù)，值得應(yīng)用及推廣。

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（收稿日期：2018-12-27 本文編輯：閆 佩）