基于羅丹明B的有機熒光探針合成及Cu2+檢測

周美宏，馮旭鳳，吳佩杉，于 淇，韋亞寧，孔令棟

（1.濟寧醫學院公共衛生學院，山東 濟寧 272067；2.濟寧醫學院醫藥工程學院，山東 濟寧272067；3.濟寧醫學院臨床學院，山東 濟寧 272067；4.濟寧醫學院藥學院，山東 濟寧 272067；5.濟寧醫學院基礎醫學院，山東 濟寧 272067）

銅離子是生物體必需的微量元素[1]，但過量攝入銅也會產生危害[2]，人體內過量積累Cu2+時，會引發肝臟的病變或者兒童肝硬化，，Wilson以及Alzheimer等[3-4]。目前許多方法可以用來檢測Cu2+，如原子吸收光譜法、電感耦合等離子體原子發射光譜法 (ICP-AES)及電感耦合等離子質譜法 (ICP-MS)等[5]。在這些檢測方法中，熒光檢測法由于具有易操作、高靈敏、快速響應以及無損傷等優點，被認為是一項有效的檢測手段[4]。

1 實驗方法

1.1 有機熒光探針的合成

1）參考文獻[7]方法，合成化合物1和2。

化合物1的合成：取1.2g羅丹明B，加入30ml無水乙醇。取3mL 80%的水合肼，逐滴加入，攪拌混合。95°C加熱、磁力攪拌，回流4h。溶液由深紫色溶液變為澄清淡橙色溶液，減壓抽濾。加入50mL 1mol/L HCl后變成紅色溶液。逐滴加入1mol/L NaOH，析出大量乳白色絮狀沉淀，pH調到9～10。將產生的沉淀減壓抽濾，15mL蒸餾水清洗3次，紅外干燥。得粉紅色固體。

化合物2的合成：取0.461g化合物1，加入20mL無水乙醇。逐滴加入700μL，30%的乙二醛溶液，室溫攪拌4h。紅外干燥，得到淡黃色固體。

2） 有機熒光探針的合成。取 0.248g化合物2分別與0.1g 3-甲氧基苯酰肼和0.0915g水楊酰肼反應，倒入30mL無水乙醇，超聲溶解。氮氣保護下80°C加熱、磁力攪拌，回流6h。減壓抽濾，紅外快速干燥，得紅褐色固體。

1.2 溶液的配制

1）配制Tris三（羥甲基）氨基甲烷緩沖溶液。

取1.2114 g三（羥甲基） 氨基甲烷，8.9998gNaCl，倒入體積比2:3乙醇水溶液溶解，鹽酸調pH到7.4。

2） 配制 1.0×10-3mol/L的熒光探針 Rh1、Rh2，儲備液和Cu2+及各種金屬離子（Ag+、Pb2+、Na+、Cd2+、Ba2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Co2+）溶液，實驗過程中稀釋成相應濃度備用。

2 實驗結果

2.1 紫外-可見吸收光譜

將1.0×10-3mol/L的熒光探針Rh1、Rh2儲備液稀釋到5.0×10-5mol/L，金屬離子溶液稀釋到1.0×10-5mol/L。取 500微升 5.0×10-5mol/L 的熒光探針Rh1、Rh2與金屬離子溶液混合進行紫外-可見光譜測試。當加入銅離子后紫外-可見吸收光譜在558 nm和559 nm處的吸收有顯著地增加，表明Cu2+與Rh1、Rh2有較好的結合。然而當將 Ag+、Pb2+、Na+、Cd2+、Ba2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+其紫外-可見吸收光譜幾乎未有任何變化。

1.0×10-3mol/L的熒光探針 Rh1、Rh2對 0～50μmol/L的銅離子進行檢測。在乙醇水溶液 [2∶3（體積比），50mm Tris-HCl無EDTA，pH7.4]中，隨著銅離子濃度的增加，探針分子的紫外-可見吸收越來越強。

2.2 熒光光譜響應

1） 將1.0×10-3mol/L的熒光探針Rh1、Rh2儲備液稀釋到5.0×10-5mol/L，金屬離子溶液稀釋到1.0×10-5mol/L。取 500μL 5.0×10-5mol/L 的熒光探針Rh1、Rh2與金屬離子溶液混合，進行熒光光譜測定。Ag+、Pb2+、Na+、Cd2+、Ba2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+其熒光響應較弱，加入Cu2+后熒光顯著增強。

2）熒光探針Rh1、Rh2對不同濃度銅離子的熒光光譜響應。

1.0×10-3mol/L的熒光探針 Rh1、Rh2對 0～50μmol/L的銅離子進行熒光檢測。在乙醇水溶液 [2∶3（體積比），50mm Tris-HCl無 EDTA，pH7.4]中，隨著銅離子濃度的增加，探針分子的熒光吸收越來越強。見圖1、圖2。

3 討論

圖1 探針Rh1對不同濃度銅離子的熒光響應

圖2 探針Rh2對不同濃度銅離子的熒光響應

本實驗中我們基于羅丹明B與3-甲氧基苯酰肼合成探針Rh1以及與水楊酰肼合成探針Rh2。在400～700 nm范圍內其它金屬離子紫外-可見吸收非常微弱。在加入Cu2+后，熒光探針Rh1在559nm處，Rh2在558nm處有較大吸收峰值。熒光探針Rh1、Rh2對銅離子的熒光光譜響應中，探針Rh1、Rh2在560nm處有較強的熒光響應，其它金屬離子熒光強度非常弱，表現出對Cu2+較好的選擇性。隨著Cu2+濃度的增加，熒光強度不斷增強，顯示出選擇性的、敏感的熒光增強反應。