固相萃取-反相高效液相色譜法對潑尼松龍片劑有效含量的測定

張 慧

（浙江仙琚制藥股份有限公司，浙江 仙居 317300）

潑尼松龍 （Prednisolone），化學名 11β,17α,21-三羥基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，為潑尼松的一種活性代謝產物，是一種合成用副腎皮質荷爾蒙制劑，具有抗炎、抑制免疫、抗病毒和抗休克等功效而廣泛用于臨床治療。目前國內對潑尼松龍的檢測報道很多[1-3]，檢測方法也較為成熟，針對不同的樣品有不同的前處理方法。食品化妝品等復雜基質的殘留潑尼松龍大都采用固相萃取技術凈化和濃縮[3-4]，而藥物類基質樣品的潑尼松龍殘留采用有機溶劑溶解后直接進樣[5]，并未采用固相萃取技術，因而不易凈化，容易產生基質干擾。固相萃取技術作為一種高效實用的前處理技術，已經被廣泛應用于食品和環境樣品等的檢測。本文擬將固相萃取技術用于藥物類基質中的潑尼松龍殘留提取與凈化，然后用反相高效液相色譜檢測。該方法不易產生干擾，重復性好，靈敏度高，可用于原料藥及藥品中潑尼松龍及有關物質的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

美國Agilent公司1100型液相色譜儀，配在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱及紫外檢測器（VWD）。高純水發生器（Milli-Q，美國MILLIPORE公司）。高速冷凍離心機 (Sigma 3k-30)。氮吹儀 (N-EVAP111，美國Organomation公司)。Oasis HLB固相萃取柱(6mL，150mg，美國Waters公司)，使用前分別用5mL甲醇和5mL水活化。潑尼松龍標準品（Sigma-Aldrich公司，純度＞98%）。甲醇色譜純(美國TEDIA公司)，其他試劑為分析純。

1.2 溶液配置

標準溶液：稱取潑尼松龍標準品0.0100g(準確至0.0001g)，用甲醇溶液定容到10mL，配置成濃度為1.0mg/mL的儲備液，于-18℃冰箱保存。臨用時用流動相稀釋成相應的標準工作液曲線。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液液 (pH=5.2)：吸取5.72mL冰乙酸至500mL容量瓶，定容到刻度。稱取27.22g三水乙酸鈉，用水溶解后定容到1000mL容量瓶。分別量取上述溶液21mL和79mL混合，用乙酸調pH值到5.2。

1.3 色譜條件

色譜柱為 C18(Inertsil ODS-SP 5μm 4.6×150mm，日本島津)；保護預柱為C18(Eclipse XDB 5μm 4.6mm×12.5mm，美國 Agilent)；流動相：甲醇/0.1%甲酸水溶液 (體積比為60/40)，流速1.0mL/min，柱溫40℃，檢測波長247nm，進樣量10μL。標準色譜圖和樣品色譜圖見圖1和圖2。

圖1 標準品

圖2 樣品

1.4 樣品前處理

準確稱取0.1g研磨好的藥品試劑 (精確到0.01g)于15mL離心管中，依次加入2mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、3mL甲醇充分震蕩混勻，用離心機在4℃1000r/min離心10min，上清液轉入15mL離心管待凈化。重復上述過程，合并上清液，用甲醇定容到10mL。取活化好的HLB固相萃取小柱，準確吸取1mL上述待凈化液體以1mL/min的流速上樣，然后依次用5mL水，3mL 30%甲醇淋洗，棄去全部淋洗液，減壓抽干。用2mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用色譜流動相定容到10mL,過0.45μm濾膜供液相色譜檢測。

2 結果與討論

2.1 線性相關性及其檢測限

將質量濃度為1.0mg/mL的儲備液恢復到室溫，用流動相配制成質量濃度為100μ/mL的工作液。上述工作液用流動相稀釋成質量濃度為10、30、50、80和100μg/mL的工作曲線，在上述色譜條件下檢測。潑尼松龍的線性方程為Y=-18.2563+15.2520×X，相關系數r=0.99919。最低檢出限為1mg/g(S/N=3)。

2.2 固相萃取條件的優化

由于潑尼松龍片劑含有大量淀粉和乳糖等，會形成基質干擾，必須對其進行凈化處理。按照傳統經典的方法，本研究采用固相萃取技術來凈化。以市售潑尼松龍片為樣品基質，采用HLB SPE小柱的凈化。結果顯示，采用HLB小柱的回收率為 87.4%～93.7%。將提取液上柱后，分別采用1、2、3和4mL甲醇進行淋洗。結果表明，采用2mL甲醇洗脫回收率最優，淋洗體積繼續增加，回收率沒有顯著變化。

2.3 方法的精密度和回收率

在不含潑尼松龍片劑的空白基質 (含淀粉、乳糖等)上添加質量濃度為10.0mg/g、20.0mg/g和50.0mg/g的質量濃度水平，各平行3次，計算其回收率，結果表明回收率范圍在87.4%～93.7%，見表1。

表2 潑尼松龍片加標回收試驗 (n=9)

2.4 討論

采用固相萃取技術來凈化潑尼松龍片劑中雜質，富集潑尼松龍化合物，然后用液相色譜檢測潑尼松龍的濃度。通過優化淋洗體積優化萃取條件，使回收率達到87.4%～93.7%。同時建立液相色譜分析條件，最低檢出限達到1mg/g。實驗結果證明，該方法雜質干擾少，重復性好，簡單快捷，可用于藥品中潑尼松龍的定性定量檢測。