擬南芥中一個鋅指蛋白AT 5 g 47610的基因克隆及表達分析

伍林濤 奉 斌 蔡 菁

(1.成都師范學院化學與生命科學學院， 成都 611130； 2.四川大學華西藥學院， 成都 610064；3.貴州省農業科學院油菜研究所， 貴陽 550008； 4.貴州省農業科學院油料研究所， 貴陽 550006)

隨著全球變暖，極端氣候事件發生日趨頻繁，尤其是高溫干旱等極端氣候事件，近幾十年在我國發生的頻率和強度增加異常顯著[1]。高溫、干旱等非生物脅迫會引起植物的形態、生化、生理和分子等方面發生變化，并導致植物的產量下降[2-4]，對農業造成的損害在世界范圍內都非常廣泛。

植物在脅迫條件下，能夠感知并傳導逆境信號，啟動相關基因的表達，從而激活相應的保護代謝途徑，如氣孔關閉、脫落酸(ABA)含量增加、抗氧化酶含量改變等。現已發現很多在脅迫應答信號中起作用的基因，一般按功能分為兩類：一類是功能蛋白，包括糖轉運子、水通道蛋白、抗凍蛋白和分子伴侶等，能夠直接提高植物的抗逆能力；另一類是調節蛋白，包括不同家族的轉錄因子、磷酸酶、蛋白激酶和E 3泛素連接酶等，主要參與調控脅迫的信號轉導以及與脅迫相關基因的表達[5-6]。而對調節蛋白的研究，以轉錄水平調控居多[7]，至于翻譯后水平調控(主要包括磷酸化和泛素化修飾)機制研究得還不透徹，是目前植物應對脅迫調控機制研究的熱點內容。其中泛素化修飾參與調控細胞生命活動的各個生理代謝過程，在細胞生命活動中發揮著至關重要的作用，特別在植物響應外界非生物脅迫的過程是不可缺少的，因此近年來引起了越來越廣泛的關注[8-9]。

泛素依賴的蛋白酶體途徑由泛素激活酶E 1、泛素結合酶E 2和泛素連接酶E 3順序催化完成，目前，已發現了一些泛素E 3連接酶能夠決定靶蛋白的特異性識別，參與植物的逆境脅迫，在泛素途徑中具有重要作用[10-12]。篩選與鑒定擬南芥中與高溫、干旱相關的E 3連接酶，分析其抗逆機制，將有助于通過基因工程手段選育耐熱耐旱的植物新品種，提高高溫干旱地區的農業生產力，具有重要的現實意義。

本研究對擬南芥中具有鋅指(RING-finger)結構，可能具有E 3泛素酶活性，并在耐熱方面起有一定作用的AT 5 g 47610進行了基因克隆及表達分析，為進一步鑒定其功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1植物材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana) Columbia (Col.)生態型為本實驗室保存。

1.1.2菌株、載體

菌株：E.coliJM 109，用于AT5G47610基因載體的構建及克隆；E.coliBL 21：用于原核表達。均為本實驗室保存。載體：PET 32 a，為本實驗室保存。

1.1.3化學及分子生物學試劑

高保真Pfu DNA多聚酶、dNTP混合物、限制性內切酶(Bam H 1、Sac 1)均購自Fermentas(MBI)公司；T 4 DNA 連接酶、2 000 bp DNA Ladder Marker購自Takara公司；DNA膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自Tiangen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1引物設計

根據在NCBI上查到的AT 5 G 47610的cDNA序列，使用primer 5.0設計引物。引物序列為：

UP:5’CGGGATCCAAGATGCGTTTGCTAGTAGCAG 3’

down:5’CGAGCTCGTGGCTTGAAGGAGTTTCAGAGT 3’

1.2.2RNA提取及反轉錄為cDNA

參照張年輝[13]的方法稍作改動提取擬南芥總RNA，利用RT-PCR制備擬南芥cDNA，反應體系(20μL)：

反應體系反應體積/μL5×RT buffer4dNTP2Super RI0.5RT-Enhancer0.5Random Primer1Oligo dT1模板(RNA)4Rever Ace1ddH2O6

反應程序：30 ℃，10 min;42 ℃，30 min;99 ℃，5 min;4 ℃，5 min。

1.2.3AT 5 G 47610基因的擴增和純化

以擬南芥cDNA為模板，構建PCR反應體系(25μL)：

反應體系反應體積/μL10×pfu Buffer(含MgSO4)2 .5dNTP2Up Primer1Dn Primer1模板(cDNA)2Taq 酶(5U·μL-1)0.5ddH2O16

PCR循環參數：94 ℃變性2 min；然后進行31個PCR循環(94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s)；最后繼續在72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR結束后，將擴增產物進行2% 瓊脂糖凝膠電泳，5 V·cm-1電泳18 min后，放入凝膠成像系統中觀察是否有目標條帶。

按上述已摸索好的反應條件配制10組相同的PCR體系，擴增后將10組合為一管用于后續的純化。配制大孔的2%瓊脂糖凝膠用于膠回收。從瓊脂糖凝膠上切下含目的基因片段的凝膠，按照Tiangen公司通用型DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit)操作步驟純化回收擴增產物。

1.2.4載體片段連接體系的構建

AT5G47610基因的克隆以PET 32 a克隆載體進行。將載體PET 32 a進行Bam H 1 和Sac 1雙酶切，與AT5G47610基因酶切片段進行連接。使用T 4 DNA連接酶的連接體系(10μL)為：

反應體系反應體積/μL10×Buffer1雙酶切純化AT5G47610基因片段2雙酶切PET32載體片段4T4 DNA連接酶1ddH2O2

16 ℃水浴過夜16 h。

1.2.5連接產物的轉化

1) 自-80 ℃中取出感受態細胞JM 109，放置于冰上至完全溶解。

2) 取5μLAT5G47610基因片段與PET 32 a的連接產物與50μL感受態細胞混勻，冰浴30 min。

3) 42 ℃熱沖擊45 s，冰浴靜置5 min。

4) 加入800μL LB，37 ℃緩慢振搖1 h。

5) 5 000 r·min-1離心5 min，吸去部分上清，余下50μL上清懸浮菌體，涂布于含50μg·mL-1Amp的LB固體平板上，37 ℃倒置培養18 h。

1.2.6表達菌株的制備及目標蛋白的誘導表達與檢測

挑選邊緣光滑，大小均一的單菌落為模板進行菌落PCR，找到陽性菌落。將菌落PCR陽性單菌落保存并擴大培養，送上海Invitrogen生物工程公司進行序列測定，收到測序結果后，與在NCBI上查詢的原始序列對比，進一步確定陽性結果的真實性。提取重組質粒, 然后轉化感受態細胞BL 21。低溫搖床誘導表達目標蛋白[14]，并進行SDS-Page 蛋白表達檢測。

2 結果與分析

2.1 擬南芥RNA的提取

RNA的質量直接影響后續實驗，由圖1的電泳結果可以看到，一個泳道共出現了3條條帶：28 S、18 S、5 S。3條條帶很清晰，沒有拖帶，說明RNA基本沒有降解，提取質量良好，RNA可用于后續實驗。

圖1 擬南芥總RNA提取凝膠電泳圖

2.2 目標基因AT5G47610的PCR擴增

以擬南芥cDNA為模板，用已設計好的帶有酶切位點(Bam H 1和Sac 1)的目的基因的引物進行PCR擴增，并膠回收結果如圖2，可以看到在Marker 560 bp位置有明亮的目標條帶，通過灰度值計算其濃度進行下一步的實驗。

圖2 AT5G47610基因膠回收后的電泳結果

2.3 載體片段連接體系檢測

如圖3所示，a、b泳道為Bam H 1 和Sac 1雙酶切后產物，b泳道雙酶切獲得的2條條帶說明AT5G47610基因已成功連接到克隆載體PET 32 a中。

圖3 載體片段連接體系酶切結果

2.4 目標基因蛋白的誘導表達

表達菌株經IPTG誘導蛋白表達，收集菌體制樣后，SDS-PAGE電泳結果如圖4。對比未添加IPTG的實驗組，可以看到添加IPTG的實驗組在40 KD蛋白Marker處均有蛋白的表達，但由于IPTG添加比例不同，目標蛋白亮度不一致。0.2 mM IPTG是最為合適的誘導濃度。

注：a—泳道無IPTG；b—泳道0.4 mM IPTG；c—泳道0.3 mM IPTG；d—泳道0.2 mM IPTG；e—泳道0.1 mM IPTG;f—泳道0.05 mM IPTG。圖4 AT 5 g 47610蛋白表達SDS-PAGE結果

3 討 論

本課題組在前期研究發現了一個具有鋅指結構的AT 5 g 47610蛋白，而它的同源蛋白AT 2 g 02960(ATPRF 1)經體外泛素化實驗驗證，為一個E 3連接酶[15],另2個同源蛋白AT 5 g 43200(AtHHR 2)[16]和AT 5 g 43420(ATL 16)[17]也被證實具有E 3連接酶的功能。因此猜測同樣具有鋅指結構的AT 5 g 47610蛋白也同樣具有E 3連接酶的功能。為此，本研究進行了AT5G47610目的基因的克隆和表達載體的構建，并成功誘導了目標蛋白的表達，為后續鑒定AT 5 g 47610蛋白的E 3連接酶活性與奠定基礎。

E 3連接酶是一種與抗逆相關的泛素連接酶。根據結構與功能機制，E 3連接酶家族主要有三大類[18]：HECT家族，U-box蛋白家族和RING-finger(鋅指)家族。其中RING-finger 家族的E 3 連接酶發現較晚，但其種類龐大且功能復雜，成為近年來研究的熱點。Ryu等在篩選擬南芥ABA不敏感突變體的過程中鑒定出AtAIRP1，它能夠編碼一個鋅指類型泛素E 3連接酶[19]。Ding等發現，擬南芥里面一個鋅指蛋白CHYR 1，具有E 3連接酶的活性，能夠提高植物的耐旱性，而其活性是通過被蛋白激酶SnRK 2.6磷酸化來調控的[20]。Park等從延遲萌發的水稻T-DNA突變體中鑒定出一個RING-finger類型泛素E 3連接酶OsDSG 1，發現與野生型相比，osdsg1突變體對干旱的耐受性增強，一系列ABA信號通路相關及響應的基因和都能夠在突變體中被誘導表達，說明OsDSG 1是依賴于ABA信號轉導的干旱脅迫響應的負調節子[21]。

篩選與鑒定擬南芥中同抗逆境相關的E 3連接酶，分析其抗逆機制，再通過基因工程的手段，將相關的E 3連接酶基因導入到其他農作物當中，將有助于獲得抗逆的新品種，從而實現傳統育種模式的新改革。