鈣離子脅迫對3種牧草種子萌發及幼苗生長的影響

(遵義師范學院生物與農業科技學院， 貴州 遵義 563006)

鈣離子是植物細胞壁的重要結構組分，也是植物必需礦質元素其中之一，在調節植物生長發育過程方面起著重要作用[1], 并且鈣離子還是液泡內重要的滲透保護物質，具有維持細胞內離子平衡并保持細胞膜穩定等功能[2-5]。此外, 鈣離子還是植物細胞響應環境變化非常重要的信號分子，耦連胞外環境信號與胞內生理反應，在外界信號的感應以及響應過程中起著極為重要的作用[6]。一定含量的鈣可以緩解鹽害、干旱、冷害、細菌等對植物造成的傷害[7-8]，對植物種子萌發和生長都有積極的影響[9]。外源鈣對絕大多數植物的鹽害效應具備一定程度的緩解作用，當植物受到低濃度鹽脅迫時，植物可以采用增加細胞質中游離Ca2+的濃度，進而借助Ca2+與CaM的結合，啟動一系列的生理生化響應機制，維持細胞質膜結構的穩定，保證光合作用的正常進行[10-11]。然而，高濃度的鈣離子可以干擾植物細胞的正常生理生化功能[5]，抑制植物種子萌發，影響其光合作用[12-14], 進而抑制植物的生長發育[15]。

喀斯特地貌以裸露的石灰巖為其主要特征[16]，其面積約占地球陸地面積的12%[17]，中國約有1/3的陸地屬于喀斯特地貌[18]。喀斯特地區土壤具有高鈣的特點，且大多土被不連續，土層也較為淺薄，土壤中含有極為豐富鈣離子, 其含量是一般酸性土壤的3倍以上[17,19]，對植物的生長和發育產生重要影響[20]。我國喀斯特地貌大多分布在人口相對集中的西南部山區，近年來隨著人地矛盾日益突出，土壤侵蝕和水土流失加劇，對喀斯特地區的農業生產造成了直接威脅。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、白車軸草(TrifoliumrepensL.)和紫云英(AstragalussinicusL.)均是我國廣泛栽培應用的優良牧草，同時，作為優質的綠肥作物，具備在喀斯特地區進行推廣種植的潛力。目前，相關研究主要集中在這3種牧草種子的耐鹽性和抗旱性方面[21-23]，關于其對高鈣土壤環境的適應性方面研究較少。本實驗用不同濃度的鈣離子溶液模擬土壤鈣離子環境，研究鈣離子濃度對3種牧草種子萌發和幼苗生長的影響，為喀斯特地區適宜牧草和綠肥作物的篩選與評價提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

材料：供試種子為市場采購的湖北鑫大葉牧草公司生產的紫花苜蓿、白車軸草、紫云英種子。

試劑：氯化鈣為常規分析純無水氯化鈣(無錫市亞泰聯合化工有限公司)。

儀器：人工氣候箱(上海博迅，BIC-400)；分析天平(上海奧豪斯，AX 523 ZH-E)；烘箱(上海一恒，DHG-9625 A)；數顯游標卡尺(日本三豐，Mitutoyo)。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計

試驗共設置6個不同鈣離子濃度處理，每處理重復4次，每重復50粒種子。采用無水氯化鈣配置不同濃度的鈣離子溶液，鈣離子濃度梯度設置為0，0.03，0.06，0.09，0.12，0.15 mol·L-1。

1.2.2種子萌發試驗

種子萌發處理：使用90 mm培養皿作為培養載體，采用2層濾紙法對種子進行培養處理。為保證3種牧草種子在培養皿中發芽環境大致相同，在整個發芽試驗期間每隔2 d用滴管吸取相同濃度溶液對種子潤洗2～3遍。整個萌發試驗均在人工氣候箱中展開，溫度20 ℃，每日光照16 h，周期為15 d，在相同條件下萌發以排除其他因子干擾。萌發實驗過程中每24 h統計1次發芽數量。種子萌發以胚根露出1 cm左右為判斷標準，萌發試驗結束以后稱量幼苗鮮重。

恢復萌發處理：將種子萌發試驗結束后培養皿中剩余未萌發的種子移出，并用蒸餾水反復沖洗3遍以上，其后將其轉入加有蒸餾水的培養皿中，采用種子萌發試驗相同的環境條件，在人工氣候箱中繼續培養10 d，每24 h統計發芽數并移除已萌發種子。

1.2.3種子萌發參數的統計和測定

種子形態:取20粒種子， 用精確度為 0.02 mm的數顯游標卡尺測量種子的長度、寬度及厚度，計算平均值及標準差。

種子百粒重: 取5個重復，用精度0.000 1 g的電子天平分別稱量百粒重，計算平均值及標準差。

種子含水率：稱取一定量的種子于鋁盒中，質量記為m0，在100 ℃烘箱中烘干至恒重，再次稱重，質量記為m，種子含水率(%)=[(m-m0)/m0]×100%。重復4次。

種子吸水率：稱取一定量的種子于鋁盒中，質量記為m0，加入蒸餾水至淹沒所有種子，浸泡24 h，其后取出種子，擦干其表面水分，稱量，質量記為m，種子吸水率(%)=[(m-m0)/m0]×100%。重復4次。

發芽率(%)=(15 d內正常發芽的種子數/每皿總種子數)×100%；

發芽勢(%)=(前5 d內正常發芽的種子數/每皿總種子數)×100%；

發芽指數=∑Gt/Dt，(式中，Gt為第t天的發芽種子數，Dt為相應的發芽日數)；

恢復萌發率(%)=(脅迫去除后恢復發芽種子數/未發芽種子總數)×100%。

表1 3種牧草種子生物學特性比較

牧草種類 種子形態/mm長寬厚百粒重/g種子含水率/%種子吸水率/%紫花苜蓿2.22±0.341.34±0.180.93±0.090.1986±0.01099.42±0.35103.03±12.57白車軸草1.14±0.090.96±0.160.68±0.060.0616±0.00088.56±1.34118.90±13.51紫云英2.81±0.331.96±0.160.78±0.100.3389±0.00223.81±0.19141.72±8.38

1.3 實驗數據處理

采用SPSS 22.0統計軟件對不同鈣離子脅迫條件下3種牧草種子的發芽率、發芽勢和發芽指數分別進行方差分析(one-way ANOVA)，并采用最小顯著差異法(LSD)對其進行多重比較。同時，采用Excel 2016軟件對所有數據進行統計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 種子基本表征

3種牧草種子的生物學特性如表1。種子形態整體上紫云英>紫花苜蓿>白車軸草，百粒重也是紫云英最大為(0.338 9±0.002 2)g。紫云英不但種子較大，且種子含水率最低，小于白車軸草和紫花苜蓿。然而，紫云英種子吸水率是3種牧草種子中最大的，達(141.72±8.38)%，其次為白車軸草，再次為紫花苜蓿。

2.2 種子萌發

不同的鈣離子溶液處理下3種牧草發芽率差異明顯(圖1)。白車軸草發芽率隨鈣離子濃度的增加呈下降趨勢，在鈣離子濃度0 mol·L-1時發芽率最大為(98.67±2.31)%。鈣離子濃度0.03 mol·L-1時發芽率和0 mol·L-1時差異不顯著，但顯著高于其他處理。鈣離子濃度0.12 mol·L-1時，發芽率快速下降，當鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時，發芽率僅為(8.00±2.00)%。紫云英發芽率也隨鈣離子濃度的增加而降低，鈣離子濃度為0 mol·L-1時發芽率最大為(85.33±9.02)%，與鈣離子濃度0.03和0.06 mol·L-1發芽率差異不顯著。鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時發芽率最低為(34.67±13.32)%。紫花苜蓿發芽率隨鈣離子濃度增加呈先上升后下降的趨勢，在鈣離子濃度為0.06 mol·L-1時萌發率最大達(82.67±3.06)%，且與鈣離子濃度0、0.03、0.09 mol·L-1時發芽率差異不顯著(p<0.05)。鈣離子濃度0.15 mol·L-1時發芽率最低為(39.33±6.43)%。總體來看，鈣離子濃度0～0.09 mol·L-1時3種牧草萌發率緩慢下降趨勢，鈣離子濃度0.12～0.15 mol·L-1時3種牧草種子萌發率快速下降，下降幅度由大到小依次為白車軸草、紫云英和紫花苜蓿。

圖1 鈣離子濃度對3種牧草種子發芽率的影響

3種牧草在不同鈣離子濃度溶液處理下發芽勢差異明顯(圖2)。白車軸草和紫云英發芽勢隨鈣離子濃度增加呈下降趨勢，二者均在鈣離子濃度為0 mol·L-1時發芽勢最大，分別為(97.33±1.15)%和(84.67±9.02)%。白車軸草在鈣離子濃度為0.12 mol·L-1時發芽勢快速降低，顯著低于鈣離子濃度為0.09 mol·L-1，到0.15 mol·L-1時發芽勢僅為(2.00±2.00)%。紫云英發芽勢也在鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時逐漸降到最低為(12.67±2.31)%。紫花苜蓿發芽勢隨鈣離子濃度增加呈先增大后減小趨勢，在鈣離子濃度為0.03 mol·L-1時達到最大值為(80.67±6.43)%，其后發芽勢緩慢下降，到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時最低，為(26.67±8.08)%。

圖2 鈣離子濃度對3種牧草種子發芽勢的影響

3種牧草種子發芽指數隨鈣離子濃度增加均呈減小趨勢(圖3)。紫花苜蓿、白車軸草和紫云英均在鈣離子濃度為0 mol·L-1時發芽指數最大，分別為23.21±1.99、34.25±1.76和16.63±2.61。其后發芽指數均逐漸降低，到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時降到最低，發芽指數分別為5.38±1.35、0.62±0.22和2.78±0.83，僅分別為鈣離子濃度0 mol·L-1時的23.18%、1.81%和16.72%。

圖5 鈣離子濃度對3種牧草幼苗生長的影響

圖3 鈣離子濃度對3種牧草種子發芽指數的影響

2.3 蒸餾水恢復萌發

將上述鈣離子溶液各處理中不萌發的種子經過反復清洗并轉入到蒸餾水中進行萌發后，3種牧草種子都快速恢復萌發，且恢復萌發率較高，達49.38%。不同鈣離子濃度處理下3種牧草種子的恢復萌發率隨鈣離子濃度的增加呈快速增加趨勢，且各鈣離子濃度下，紫花苜蓿恢復萌發率均最高，其次為紫云英，再次為白車軸草(圖4)。

2.4 幼苗生長

萌發結束以后，不同鈣離子濃度處理3種牧草幼苗生長差異明顯(圖5)。白車軸草幼苗濕重隨鈣離子濃度增加呈減小趨勢，由鈣離子濃度為0 mol·L-1時的(0.006 1±0.002 7)g減少到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時的(0.003 2±0.000 5)g。紫云英幼苗濕重隨鈣離子濃度也呈減小趨勢，由鈣離子濃度為0 mol·L-1時的(0.032 5±0.008 2)g減少到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時的(0.007 6±0.000 9)g，且鈣離子濃度為0 mol·L-1時紫云英幼苗已經長出第一片真葉。紫花苜蓿幼苗濕重隨鈣離子濃度增加呈先增大后減小趨勢，鈣離子濃度為0.03 mol·L-1時幼苗濕重最大達(0.023 7±0.003 2)g，其后濕重一直減小，到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時最小為(0.004 9±0.000 8)g。

圖4 不同鈣離子濃度下牧草種子的恢復萌發率

3 討 論

3.1 鈣離子脅迫對3種牧草種子萌發的影響

紫花苜蓿、白車軸草和紫云英作為優良的牧草和綠肥作物，以其重要的飼用價值和水土保持價值，是喀斯特地區發展草地畜牧業，帶動經濟發展與改善生態環境的重要備選牧草品種。研究表明，白車軸草和紫云英種子發芽率、發芽勢和發芽指數均隨鈣離子濃度的增加總體呈減小趨勢，鈣離子濃度較高時(0.12～0.15 mol·L-1)下降尤其明顯。原因可能是隨著鈣離子濃度增加，脅迫增強，引起種子周圍水勢降低，導致細胞內外水勢差隨之減小，致使種子吸水困難，加之胚乳內儲藏物質不能動員，呼吸作用受到強烈抑制，種子難以萌發[24]。Cai等研究發現，高濃度鈣離子(0.09 mol·L-1)能夠明顯抑制蘿卜(Raphanussativus)種子萌發[25]，與本試驗研究結果相一致。同時，隨鈣離子濃度的增加，紫花苜蓿種子發芽率和發芽勢呈先增大后減小趨勢。這與劉小麗等[26]對不同鈣離子濃度處理下香椿(Toonasinensis)種子發芽率、發芽指數的變化結果相一致。總的來說，低濃度鈣離子脅迫對3種牧草種子發芽影響有限，而高濃度鈣離子脅迫能夠明顯抑制3種牧草種子萌發，且低濃度鈣離子(0.03～0.06 mol·L-1)脅迫可以促進紫花苜蓿種子萌發，提高其發芽率，對高鈣環境的適應能力優于白車軸草和紫云英。

3.2 3種牧草種子鈣離子脅迫去除后的恢復萌發能力

將萌發試驗中不同鈣離子濃度處理下未萌發的種子，經過反復清洗后轉入到蒸餾水中繼續培養，3種牧草種子均快速恢復萌發。高濃度鈣離子濃度溶液中轉移來的3種牧草種子其恢復萌發率均高于低濃度鈣離子濃度溶液中轉移來的種子，且紫花苜蓿恢復萌發率大于白車軸草和紫云英。原因可能是鈣離子濃度并沒有超過3種牧草種子的耐受極限，沒有對牧草種子造成永久性的傷害。這與黃振英[27]、呂朝燕[28]等對NaCl脅迫下梭梭(Haloxylonammodendron)種子萌發的研究結果一致。同時，UNGAR[29]對部分一年生鹽生植物(Salicorniaeuropaea，Spergulariamarina，Suaedadepressa以及Suaedalinearis)在NaCl脅迫條件下的種子萌發過程進行了系統研究，其在恢復試驗中觀察到了與本試驗類似的恢復萌發現象。可以認為，在鹽脅迫尚未超過植物種子耐受閾限時，鹽濃度引起的滲透壓改變限制了種子的萌發，而不是金屬離子的毒性對種子造成了永久性損害，當鹽脅迫減輕或消失以后，植物種子仍然具備較強的萌發能力。可見，鈣離子脅迫去除以后，3種牧草種子均具有較強的恢復萌發能力，且紫花苜蓿好于白車軸草和紫云英。

3.3 鈣離子脅迫對3種牧草幼苗生長的影響

鈣離子在植物生長發育過程當中具有非常重要的作用，然而在喀斯特地區, 土壤中過多的鈣離子可以抑制植物的正常生長，降低作物的產量, 甚至給農業生產帶來嚴重影響[30]。試驗結果表明，白車軸草和紫云英幼苗生長受到鈣離子濃度的明顯抑制，幼苗濕重隨鈣離子濃度增加而呈下降趨勢。Kanashiro等[31]通過在MS培養基中添加不同濃度鈣離子，發現在鈣離子濃度(0.12 mol·L-1)較高時，鳳梨科植物(Aechmeablanchetiana)幼苗的干重和鮮重均顯著降低，這與本試驗研究結果一致。同時，紫花苜蓿幼苗在鈣離子濃度(0.03 mol·L-1)較低時，其生長好于其他處理，可以認為該鈣離子濃度是紫花苜蓿幼苗生長的最適濃度。Al-Whaibi等[32]用不同濃度(0～0.10 mol·L-1)的CaCl2溶液處理蠶豆(Viciafaba)幼苗，研究發現0.06 mol·L-1為蠶豆幼苗生長的最適濃度，與本試驗研究結果類似。總的來說，鈣離子能夠明顯抑制3種牧草幼苗的生長，低濃度鈣離子(0.03 mol·L-1)脅迫可以促進紫花苜蓿幼苗的生長。因此，初步認為紫花苜蓿對高鈣環境的適應能力要好于白車軸草和紫云英，是喀斯特地區較為適宜的栽培牧草品種。