基于PCR的兩步法絲狀真菌基因敲除方法

謝 鑫， 蔣君梅1， 王 勇1， 任明見

(1.貴州大學農學院， 貴陽 550025； 2.國家小麥改良中心貴州分中心， 貴州 貴陽 550025)

真菌在自然界廣泛分布，與人類生活的各個方面都有著密不可分的聯系[1]。因此對真菌進行研究，尤其對真菌的基因功能進行研究具有重要意義。通過對真菌DNA進行遺傳改造是基因功能研究的重要技術，目前，對絲狀真菌進行遺傳改造的方法主要有PEG介導的原生質體轉化、農桿菌介導的轉化(A.tumeafeiensmediatedtransformation, ATMT)、電擊轉化和基因槍轉化等[2-3]。基因敲除是研究基因功能的手段之一，利用同源重組原理對感興趣的基因進行敲除，通過觀察敲除突變體的表型變化從而明確該基因的功能，最終實現改良或防治真菌的目的。目前，常用的基因敲除的方法有： 1) 同源重組基因敲除，即利用基因兩側的同源臂在位點特異性DNA重組酶的作用下進行基因敲除，該法是最普遍的基因敲除方法； 2) 基因沉默(RNA silence)誘導的基因敲除，即通過構建小的雙鏈RNA片段干擾基因的表達，并且這種干擾效應會持續“傳遞”到子代細胞，從而造成基因敲除； 3) 轉座子和逆轉錄轉座子標簽法，即通過轉座子在基因組中 “跳躍”，從而造成染色體的畸變或基因的缺失[4-6]。以上的基因敲除方法最終都需要篩選標記對敲除突變體進行篩選，絲狀真菌基因敲除時常用的篩選標記有潮霉素、氯嘧磺隆(SUR)和G 418等[7]，存在篩選效率低、假陽性率高等缺點。因此，本研究對此做了改進，利用同源重組的原理，采用兩步法PCR進行基因敲除，并利用潮霉素和綠色熒光蛋白(GFP)同時進行轉化子的篩選，大大提高了篩選效率，其操作流程見圖1。……