51份紅三葉種質資源萌發期耐銅性評價

趙思怡， 陳 菲， 張鶴山2， 張志飛

(1.湖南農業大學農學院， 長沙 410128； 2.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所， 武漢 430064)

紅三葉(TrifoliumpretenseL.)是豆科(Leguminosae)三葉草屬多年生草本植物，原產于小亞西亞及歐洲西南部，在我國大部分省份有栽培[1]。紅三葉側根發達，且根瘤多，耐陰性較強，可用于果樹全園內或行間種植[2]，具有維持果園生態系統穩定性、培肥地力、減輕病蟲雜草危害等作用。而常期噴施含銅殺菌劑或施用規模畜禽養殖糞便的老果園土壤中銅污染嚴重[3]。銅是植物生長發育所必需的營養元素，也是重金屬污染元素，銅可維持植物正常生理代謝過程，但過量的銅會造成植物水分代謝、光合作用、呼吸作用等各種生理代謝紊亂[4]，抑制植物生長，甚至造成植物死亡。不同植物對銅脅迫的耐受性差異較大，選育高耐銅品種是解決銅污染問題較為經濟便捷的措施。本研究以51份紅三葉種質資源為研究對象，利用中等脅迫強度的Cu2+進行發芽實驗，比較Cu2+脅迫與對照的發芽指標和根系指標差異，對發芽指標和根系指標相對值進行相關性分析與主成分分析篩選耐銅性評價指標，采用加權隸屬函數法和聚類分析對51份紅三葉種質資源進行耐銅性綜合排序與分類，旨在研究萌發期紅三葉對高銅濃度的脅迫反應，為紅三葉耐銅性品種選育與推廣提供依據。

表1 51份紅三葉種質資源基本信息

編號材料名稱編號材料名稱編號材料名稱編號材料名稱H1CF002082H14CF022175H27CF022190H40CF022224H2CF005803H15CF022176H28CF022197H41CF022227H3CF022150H16CF022177H29CF022199H42CF022228H4CF022153H17CF022178H30CF022201H43CF022229H5CF022156H18CF022179H31CF022202H44CF022231H6CF022163H19CF022180H32CF022204H45CF022232H7CF022165H20CF022181H33CF022207H46CF022234H8CF022167H21CF022183H34CF022211H47CF022235H9CF022168H22CF022185H35CF022212H48CF022236H10CF022170H23CF022186H36CF022217H49CF022321H11CF022171H24CF022187H37CF022219H50CF022324H12CF022172H25CF022151H38CF022222H51CF022325H13CF022174H26CF022189H39CF022223

1 材料與方法

1.1 材 料

51份紅三葉種質資源均由湖北省農科院畜牧獸醫研究所提供(表1)，為來源于俄羅斯的野生種質資源。

1.2 試驗方法

選取均勻一致、無病蟲害的種子，以50%的多菌靈可濕性粉劑(山東華陽農藥化工集團有限公司生產)500倍液浸泡種子20 min，用蒸餾水沖洗2～3遍待用。

參照國家牧草種子檢驗規程——發芽試驗(GB/T 2930.4-2001)，以前期實驗篩選的中等脅迫強度的Cu2+(CuSO4·5 H2O為銅源，100 mg·L-1)對51份紅三葉種質資源進行銅脅迫發芽試驗，以去離子水為對照，每重復50粒種子，4次重復。人工氣候箱培養條件為20 ℃恒溫，16 h光照/8 h黑暗培養。每隔24 h統計1次種子發芽數，逐日觀察記載發芽種子數，以胚根或胚芽突破種皮長于種子長度為發芽標準，第10天結束試驗。分別統計種子發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數[5]。

第10天結束試驗時，每處理隨機選取10株幼苗，清水洗凈，以LA-S系列植物根系分析系統軟件(杭州萬深檢測科技有限公司)進行根系掃描分析，統計總根長(mm)、根系體積(mm3)、根系表面積(mm2)、根系平均直徑(mm)、根尖數(個)等。

1.3 數據處理與分析

指標相對值(%)=(指標脅迫處理值/指標對照處理值)×100%。

運用SPSS 22分析軟件進行數據處理與分析。根據9個萌發指標和根系指標相對值的相關性分析和因子主成分分析結果，篩選耐銅性評價指標；以變異系數賦予權重，用加權隸屬函數法計算綜合隸屬函數值，對51份紅三葉種質資源進行耐銅性排序；用系統聚類法進行聚類。

2 結果與分析

2.1 Cu2+脅迫對紅三葉種子萌發與根系生長的影響

銅脅迫處理的51份紅三葉種質材料的發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、總根長等5項指標顯著低于空白對照(p<0.05)；根系體積、根系平均直徑顯著高于空白對照(p<0.05)；根系表面積、根尖數與對照無顯著差異。說明100 mg·L-1Cu2+脅迫對紅三葉的萌發指標有顯著抑制作用，但促進根系體積、根系平均直徑的發育。51份紅三葉種質材料在銅脅迫下，發芽指標變異系數波動范圍(64.7%～70.9%)大于對照發芽指標的波動范圍(20.7%～37.2%)；根系指標的變異系數相對較小。表明在100 mg·L-1Cu2+脅迫下紅三葉發芽指標的品種間差異大于根系間差異。

表2 51份紅三葉種質資源不同處理下觀測指標值的比較

觀測指標 銅脅迫組 對照組 均值標準差變異系數/%最大值最小值均值標準差變異系數/%最大值最小值發芽勢/%34.0b24.170.983.51.553.7a12.723.686.521.0發芽率/%37.3b24.164.783.51.560.5a12.520.791.529.5發芽指數30.6b21.770.778.72.950.2a15.330.580.516.8活力指數99.4b67.067.4285.612.9248.2a92.437.2459.868.9總根長/mm3.5b0.721.25.02.34.9a0.714.66.43.5根系表面積/mm27.2a1.723.610.94.47.2a1.621.710.95.0根系體積/mm31.2a0.428.22.10.70.9b0.333.01.70.5根系平均直徑/mm0.7a0.06.10.70.60.5b0.112.50.70.3根尖數/個1.1a0.214.01.51.01.2a0.213.61.71.0

注：同一行的不同小寫字母表示水平差異顯著(p<0.05)。

表3 各指標相對值相關性分析

觀測指標 相對發芽勢相對發芽率相對發芽指數相對活力指數相對總根長相對根系表面積相對根系體積相對根系平均直徑相對發芽率0.951??相對發芽指數0.961??0.950??相對活力指數0.879??0.870??0.921??相對總根長-0.384?-0.431-0.376??-0.059相對根系表面積-0.514??-0.571??-0.501??-0.2410.926??相對根系體積-0.541??-0.603??-0.527??-0.318?0.805??0.964??相對根系平均直徑-0.513??-0.565??-0.509??-0.477??0.294?0.611??0.766??相對根尖數-0.148-0.107-0.156-0.0150.453??0.434??0.401??0.121

2.2 指標相對值的相關性分析

51份紅三葉種質資源發芽、根系等9項指標在銅脅迫和空白對照的相對值進行兩兩相關性分析，結果發現：相對發芽勢除與相對根尖數沒有統計學相關性外，與其他7項指標均有極限著或顯著相關性關系(p<0.01或p<0.05)；相對根系體積、相對根系平均直徑與4項發芽指標相對值間均存在兩兩極限著負相關(p<0.01)，與其他3項根系指標相對值間存在極限著正相關(p<0.01)。總體來看各指標的相對值間相互關聯程度較高。

2.3 耐銅性評價指標的篩選

對51份紅三葉種質資源發芽、根系等9項指標在銅脅迫和空白對照的相對值進行因子主成分分析(表4、表5)。結果表明，前2個成分的累積貢獻率達到82.589%，且特征值都大于1，第一主成分特征值為5.411，貢獻率為60.126%，對應特征向量中載荷較大的3個指標是相對發芽率、相對發芽勢和相對發芽指數。第二主成分特征值為2.022，貢獻率為22.463%，對應特征向量中載荷較大的2個指標為相對活力指數和相對總根長。根據指標相關性分析和因子主成分分析結果，選擇在第一主成分或第二主成分中特征值較大，且具有代表性的指標作為紅三葉耐銅綜合評價指標，分別為：相對發芽率、相對活力指數和相對總根長。

表4 3個主成分的特征值以及貢獻率

主成分特征值貢獻率/%累積貢獻率/%Ⅰ5.41160.12660.126Ⅱ2.02222.46382.589

表5 各因子載荷矩陣

觀測指標 主成分ⅠⅡ相對發芽勢0.8890.378相對發芽率0.9150.337相對發芽指數0.8890.398相對活力指數0.7370.634相對總根長-0.6610.638相對根系表面積-0.8190.544相對根系體積-0.8480.459相對根系平均直徑-0.7170.045相對根尖數-0.3310.538

2.4 紅三葉耐銅性隸屬函數綜合評價以及聚類分析

51份紅三葉種質資源的相對發芽率、相對活力指數、相對總根長等3項指標為紅三葉耐銅性評價指標，以其變異系數賦予權重分別為0.41、0.43和0.16；以此計算綜合隸屬函數值(D值)(表6)。采用歐氏距離法對51份種質資源進行聚類分析。結果發現，51份紅三葉在歐氏距離5處可分為3個類群。其中第1類群包括編號為H 24、H 15、H 48、H 10、H 11和H 8等6份種質資源，其耐銅性綜合隸屬函數值較大，耐銅性最強。第2類群耐銅性居中，包括H 23、H 3和H 21等19份種質資源。第3類群耐銅性較弱，有H 16、H 45和H 47等26份種質資源。

表6 51份紅三葉種質資源耐銅性隸屬函數分析

編號指標隸屬函數值相對發芽率相對活力指數相對總根長綜合隸屬函數值排序H10.5330.4000.3340.44420H20.3840.2210.1550.27729H30.6020.6270.4940.5968H40.5450.4670.5120.50615H50.4310.1740.0000.25234H60.5060.2960.2170.36925H70.7150.3780.0290.46118H80.7060.7720.4460.6936H90.5880.4480.2770.47817H100.9630.8490.1830.7894H110.7250.7610.4330.6945H120.6000.3200.0070.38423H130.5970.4210.1470.44919H140.6880.4090.1320.47916H151.0000.9220.1060.8232H160.3960.2740.1550.30526H170.6840.5150.4420.57210H180.6830.5520.1110.53513H190.4930.6560.3960.54812H200.5520.5450.2880.50714H210.6800.5570.4670.5939H220.4460.4000.1820.38424H230.5580.7010.4380.6007H240.8940.9530.3000.8241H250.7170.5600.1350.55611H260.1490.4911.0000.43221H270.2570.1240.3830.22037H280.3500.1220.1990.22836H290.1570.0490.1670.11247H300.2470.2460.3340.26032H310.0750.0230.1660.06750H320.1490.1380.2880.16744H330.0470.0000.2230.05551H340.0730.0710.6150.15945H350.1030.1020.5060.16743H360.1000.1110.6090.18641H370.1470.1230.5650.20339H380.0600.0260.2460.07549

續表6

編號指標隸屬函數值相對發芽率相對活力指數相對總根長綜合隸屬函數值排序H390.0460.0480.5950.13546H400.2100.1790.5660.25433H410.1840.1810.7460.27330H420.1150.1460.4340.17942H430.2900.3620.9700.43022H440.0000.0310.4990.09348H450.1270.2950.7830.30427H460.1050.1310.6990.21138H470.1380.2160.9320.29828H480.6571.0000.7030.8123H490.1520.1670.3800.19540H500.2580.2280.3890.26631H510.2520.1410.4870.24235權重0.410.430.16

圖1 51份紅三葉種質資源耐銅性聚類

3 討 論

3.1 耐銅性鑒定指標的篩選及綜合評價方法

植物耐受銅脅迫的抗性機理非常復雜，可能表現為多種生理過程的綜合反應[6]，多指標的綜合鑒定極為重要。多指標鑒定已成為鹽[7]、旱[8]、堿[9]、重金屬[10-11]等非生物脅迫抗性鑒定的共識。劉紅云[12]南粳39的根系凈伸長量為指標對167個水稻品種耐銅性進行篩選。張黛靜等[13]利用根長相對值、株高相對值、相對根系活力、總根長相對值、根體積相對值和根表面積相對值等6個生長生理指標的相對值進行平均隸屬函數和聚類分析，將37個小麥品種分為強、中、弱三大類。本研究利用主成分分析和相關性分析，從9個指標中篩選出3個指標(相對發芽率、相對活力指數和相對總根長)；并根據變異系數求出各指標權重，進行隸屬函數值計算，再利用聚類分析將51份紅三葉種質資源分為3個耐銅性類群。本研究在較全面了解紅三葉銅脅迫條件下的萌發特性和根系生長特性的前提下，利用統計學方法對眾多材料進行耐銅性分類，較為準確簡捷，適用于大量材料耐銅性的初級篩選。

3.2 萌發期植物耐銅性特性

植物萌發期對外界環境較為敏感，對萌發期植物材料進行抗性鑒定可操作性強、周期短、效率高[9，12]。銅主要積累在草本植物的根部，從而減少對地上部分的毒害作用[14-16]，根部危害較地上部更為明顯，危害發生時間更早；但不同植物種間以及同一植物的不同品種間對銅的耐受能力差異較大。與紅三葉同屬植物白三葉(T.repensL.)可在質量比重1∶5的尾礦和蒸餾水的浸提液中萌發，但發芽率和胚根長度顯著下降，銅尾礦中銅含量嚴重超過《中華人民共和國國家標準土壤環境質量標準》(GB 15618-1995)三類標準，達到3 536.79 mg·kg-1。說明白三葉對銅脅迫的耐受能力較強，可作為銅尾礦修復的先鋒植物[17]。白三葉、紅豆草(OnobrychisviciaefoliaScop.)、檸條(CaraganakorshinskiiKom.)、胡枝子(LespedezabicolorTurcz.)等4個豆科植物的銅脅迫發芽試驗結果表明，在CCu2+≤300 mg·L-1濃度范圍內，紅豆草的發芽率逐漸增加；CCu2+>300 mg·L-1后，隨著CCu2+濃度增加，發芽率顯著下降；而白三葉和檸條的發芽率在CCu2+≤300 mg·L-1濃度范圍內，呈不規律變化。胡枝子的發芽率始終隨著CCu2+>100 mg·L-1的濃度增加而下降。4種豆科牧草在CCu2+≤300 mg·L-1濃度范圍內，根系受影響無明顯規律。而CCu2+>300 mg·L-1后，根系受到明顯抑制，500 mg·L-1Cu2+時，僅紅豆草仍有根長，其他3種牧草已無根系發育[18]。相比較而言，蔬菜種子黃瓜(CucumissativusL.)和蘿卜(RaphanussativusL.)較豆科牧草的耐銅性差。黃瓜和蘿卜分別在80、100 mg·L-1Cu2+時，發芽率受到抑制；在60、40 mg·L-1Cu2+時根長受到抑制[19]。CCu2+≥80 mg·L-1時對大田作物小麥(TriticumaestivumL.)種子發芽及幼苗苗長、根長等有抑制作用[20]。本研究中用100 mg·L-1Cu2+脅迫時參試的51個紅三葉種質資源的萌發指標和根長都有顯著抑制作用(p<0.05)，但根系增粗，可見紅三葉萌發期的耐銅性也較強。

4 結 論

100 mg·L-1Cu2+脅迫對紅三葉的萌發指標和根長有顯著抑制作用(p<0.05)，但促進根系增粗；根據9個指標相對值的兩兩相關性分析和主成分分析篩選出相對發芽率、相對活力指數和相對總根長作為紅三葉萌發期耐銅性綜合評價指標，51份紅三葉種質資源分為三大類：H 24、H 15、H 48、H 10、H 11和H 8等6份為耐銅性紅三葉種質資源，H 23、H 3和H 21等19份為中等耐銅紅三葉種質資源，H 16、H 45和H 47等26份為不耐銅紅三葉種質資源。