大豆種子老化MDA和4-HNE的含量變化相關性研究

(1.湖南師范大學生命科學學院 ， 長沙 410081； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所， 北京 100081)

種子的老化或劣變是指隨著種子貯藏時間的延長而發(fā)生的不可逆的種子活力或萌發(fā)力下降的過程。大量研究表明，種子老化過程中，細胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸在活性氧(ROS)的作用下發(fā)生脂質過氧化，其終產(chǎn)物包括一些小分子醛類物質，丙二醛(MDA)和4-羥基壬烯醛(4-HNE)等，會產(chǎn)生細胞毒害作用，影響信號轉導和正常生理活動甚至導致細胞凋亡[1]。

大豆種子含有大約40%的蛋白質和20%的油脂，屬短命種子[2]，在儲藏過程中容易老化或劣變，導致種子質量下降，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。由于種子自然老化歷時長，因此，通常采用人工加速老化法模擬自然老化來預測大豆種質的儲藏耐性及探討有關的生理生化機制[4-9]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，與未老化種子相比，自然老化的水稻種子中4-HNE含量顯著升高，可作為水稻種子老化早期的預警指標[3]，但迄今鮮見對大豆中4-HNE等小分子醛類的研究報道。因此，本試驗比較了大豆種子在人工老化和自然老化過程中，脂質過氧化產(chǎn)生的MDA和4-HNE等的含量變化、4-HNE積累的組織特異性及其合成和清除相關的基因表達調控的差異，以期為生產(chǎn)實踐中監(jiān)控大豆種子活力提供合適的生理生化指標。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及處理

大豆[Glycinemax(L.) Merr.]品種“中豆27”，由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所提供。

大豆種子置于 25 ℃、75% RH條件下平衡1周, 測得種子萌發(fā)率為99%，含水量為11.6%。 人工老化處理：種子用鋁箔袋密封包裝，于40 ℃老化箱中分別人工老化8，12，19 d，種子萌發(fā)率分別降至80%、50%和7%；自然老化處理：種子用鋁箔袋密封包裝,于室溫條件下分別貯藏60，75，150 d，種子萌發(fā)率分別降至80%、50%和4%。

1.2 實驗方法

1.2.1電導率檢測

每個處理選取大小一致且無損傷的種子10粒, 5次重復。用去離子水沖洗3次，濾紙吸干種子表面水分后裝于潔凈試管中，加入25 mL去離子水，25 ℃保溫，用電導儀測定種子浸泡液的初始電導率(a1)，然后分別測定種子浸泡6，12，18 h和 24 h的浸泡液電導率 (a2)，再將裝有種子連同浸泡液的試管置于100 ℃水浴中15 min，取出冷卻至25 ℃，再次測定種子浸泡液電導率(a3)。

表1 用于檢測大豆老化種子胚中4-HNE合成及清除相關的基因轉錄水平的引物

途徑酶基因名稱基因功能正向引物(5′-3′)反向引物(5′-3′)合成 15-脂氧合酶LOX1.1種子亞油酸13S-脂氧合酶-1GGGCCGTAGTGTCTCCCTTCTGCAGACTCTCCTGCTCCCA 氫過氧化物裂解酶LOC100810890 類9二乙烯醚合酶GCGCAGGGTGGGTTAGTGAACTGATCCAACGCCCGGAGAC 烯醛加氧酶LOX1.2 脂氧合酶-2ATGGATGACCGATGAAGAAAATAACCTCCGACTTGCTALOX1.3 脂氧合酶-3ATTGAGGATCCATCGTGCCCGCAGGCTTGGAGTTCAGGATLOX1.4 種子亞油酸9S-脂氧合酶GGCCAAGGCGTCAGCTTAGTATCCTGCCTTGCTCCCAACG 環(huán)化酶LOC100802743 類環(huán)化酶2GGGCAAAGCATGGAAGTGACATGTGCCACAGCTCCTTCAALOC100799842未標記蛋白 GCTGTCCGTTGGAGGTGCTAGTGTCACTGCCGTGTTTGCCLOC 100800915可能的環(huán)化酶4AAAGGAAAATTCTGCACGCAAAACTTCGCCACCCTTGAACALOC100800378可能的環(huán)化酶5GCTTCCTCTCATGCCTCAGAAAAGGAAGCCAAGATCCCATTCCLOC100306686未標記蛋白 GCAAGCATGGAAGTGACTCTGGTGCTAGCAAGCCATCCAGCGTALOC106794499 可能的環(huán)化酶4CGACAGGAACCACGATGGCAGTCAAAGTACCGGGCGGGTTLOC100813066環(huán)化酶2TTGGCTGGGCTGCCAGTAAGTCAAAGCAACGCCTCACAGC清除 醇脫氫酶LOC100783318 醇脫氫酶AGGTAGCTCCACCACAGGCAGCACATGATCACCGGGCTTGLOC100775490 類2環(huán)化酶脫氫酶1TCATCGTCGTGGCTTTGTGAGAAGGGTGAGAGATGCCACTLOC100800668類醇脫氫酶1ACTACAAACCACGCACCGATCATCTCACTCTTGCATGCGGLOC100783858 ADH2醇脫氫酶家族蛋白質CGCACTGACCTTCCTTCTGTTGCATCTGATGGACTCCCCTLOC547658 醇脫氫酶1TTCAGGGATTGTGGAGAGCGCACTCAGCATAACACCCCTGT 醛脫氫酶LOC100803104 醛脫氫酶家族3成員H1ACTGAGCCACATTAGCGTTGATATATACTACACGAGAGAGACGCLOC100811186 醛脫氫酶家族7成員A1TTCCCCATCCCATGTGTGTCCCAATGTTGGAGGAGCCCAALOC100811501 醛脫氫酶家族2成員B4ATGCGAGCACTGAGGGTTGGACCCTTCTCCCTGCCAATGCLOC100782019醛脫氫酶家族2成員B7TGTGCTGAGCAGAGATGTCACCCTTTACCCCATTGTGAACG 細胞色素P450GLYMA11G06381類細胞色素P450 82A3TCAAATCGTGGTTTGTCGTCTACCACGGGTTTTCACGATCAGLYMA17G01110類細胞色素P450 71D8ACTGGCATGATGCAGACAGCCCCGGGCACATTCTCCTTCCGLYMA19G32880 類3,9-二羥基紫檀酸6A單加氧酶TTCCGAGGGCTAACCCCATATCTCTCTTTCACTGGGTATTGATGAGLYMA03G29950類細胞色素P450 93A1ACTCTGCATGTCCGAGCTTCTGACTCAGCGTCATTCTGGATGLYMA07G05820 細胞色素P450 78A3TGTGAAATGGCTAACCCGCTGGCCATGCACCTGCTACTTA 谷胱甘肽轉移酶GLYMA15G40260類3谷胱甘肽S轉移酶3TGGCAGACGAGGTTGTTCTAGGGCAAGATGGGAGCTTTGTGLYMA07G16810可能的谷胱甘肽S轉移酶CCCTTTTGTGCACGAAGTCCACAGCAATAACTCAACAAGACACAGLYMA07G16830可能的谷胱甘肽S轉移酶TCAAAGCCCGCTATGAAAGTCTACTGAAATGGCCAAAACGAAA

相對電導率(%)=[(a2-a1)/(a3-a1)]×100。

1.2.2丙二醛檢測

采用王愛國等[10]的TBA比色法。取0.1 g(干重，DW)的大豆胚軸，每個處理3次重復。

MDA含量(μmol·g-1)=C×(V/W)。

1.2.34-HNE的提取及檢測

采用Fu SZ[4]的方法。

1.2.44-HNE免疫組化染色

大豆種子吸脹20 h，胚軸經(jīng)脫水，透明，浸蠟，包埋后連續(xù)切片獲 8μm厚的薄片，切片于50 ℃烘烤后經(jīng)二甲苯脫蠟，70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇2次，逐級脫水，復水后加5%BSA封閉20 min，加入兔抗4-HNE 抗體(1∶150)，室溫孵育90 min，滴加二抗和SABC-AP，BCIP/NBT 顯色，脫水透明后封片觀察。每個處理10次重復。用封閉液代替一抗作陰性對照，4-HNE處理過的切片染色結果作陽性對照。

1.2.54-HNE基因表達分析

每個處理剝?nèi)∥?0 h種子胚軸30顆，3次重復。送北京源宜基因科技股份有限公司進行轉錄組測序分析。Ayala A 等[11]報道的大豆的8類29個4-HNE合成及清除相關酶的基因，利用Primer 5(Premier Biosoft,Palo Alto,CA,USA)設計RT-PCR引物(表1)，由北京三博遠志公司進行引物合成。用北京天根公司的RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒進行總RNA提取和cDNA反轉錄；用ABI 7500 fast Real Time PCR (Applied Biosystems, USA)和Tiangen SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)進行qRT-PCR，以大豆act11.1基因為內(nèi)參基因。PCR產(chǎn)物送北京源宜基因科技股份有限公司測序。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

每個處理3次重復的平均值，用PASW statistics 18軟件和One-way ANOVA軟件進行數(shù)據(jù)分析。處理間p<0.05時視為具有顯著性差異。免疫組化染色利用 Image Pro Plus 軟件(版本 6.0)進行半定量統(tǒng)計分析。用Graphpad 5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 種子老化過程中種子浸泡液的電導率變化

種子浸泡液電導率可以表示細胞膜的完整性。圖1 結果表明，未老化大豆種子浸泡0～24 h期間相對電導率保持在20%以下；老化后種子相對電導率則隨老化程度而增大，說明老化處理導致細胞膜完整性下降；相同萌發(fā)率的自然老化種子浸泡24 h，其相對電導率高于人工老化種子17%～23%，表明自然老化細胞膜完整性受損更嚴重。

2.2 種子老化過程中MDA含量的變化

相比未老化種子，人工老化至萌發(fā)率為80%、50%和7%的種子的MDA含量分別增加了3.2%、20.6%和22.4%(圖2 a)；而自然老化至萌發(fā)率為80%、50%和4%的種子MDA的含量分別增加了5.4%、18.5%和12.2%(圖2 c)，表明人工老化和自然老化均引起MDA含量的增加。相關性分析結果顯示，MDA含量與萌發(fā)率呈負相關關系，說明膜脂氧化越嚴重，種子活力越低。未老化種子以及人工老化和自然老化至萌發(fā)率為80%和50%的種子吸脹后，MDA含量均比未吸脹種子明顯下降(圖2 b)，說明萌發(fā)率在50%以上的種子吸脹時可部分抑制或修復脂質過氧化作用。但人工老化至萌發(fā)率為7%的種子吸脹后，MDA含量比未吸脹種子高，自然老化至4%的種子吸脹后的MDA含量與未吸脹種子相近(圖2 c、d)，說明老化程度嚴重的種子吸脹時可能已失去修復能力。

注：AA為人工老化；NA為自然老化； 80%、50%、7%和4%為萌發(fā)率。圖1 大豆種子浸泡液的電導率變化

2.3 種子老化過程中4-HNE的含量變化

相比未老化種子，人工老化至萌發(fā)率為80%、50%和7%的種子的4-HNE含量分別增加了19.2%、16.5%和88.0%(圖3 a)，表明人工老化加劇了脂質過氧化。自然老化至萌發(fā)率為80%和50%的種子中，4-HNE含量分別下降了49.6%和32.8%，而自然老化至萌發(fā)率為4%的種子的4-HNE含量上升了33.6% (圖3 c)。表明不同老化條件下種子的4-HNE的合成與代謝可能存在差別。對比不同老化處理至相同萌發(fā)率的種子，發(fā)現(xiàn)人工老化條件下4-HNE積累量更高，說明人工老化脂質過氧化程度更嚴重。

老化至不同萌發(fā)率的種子吸脹后的4-HNE含量變化規(guī)律與未吸脹時不同，且自然老化和人工老化的變化模式也有差異(圖3)，表明4-HNE在自然老化和人工老化處理的種子中，其合成與代謝可能存在差異，這種差異可能與4-HNE的揮發(fā)性和不穩(wěn)定性[12]有關，或者是自然老化和人工老化條件下細胞膜完整性變化不一致，也可能是檢測4-HNE時的人為誤差導致，原因需要進一步分析。

注：AA為人工老化；NA為自然老化，0 h和20 h表示吸脹0 h和20 h。圖中不同小寫字母表示各處理間差異顯著(p<0.05)。下同。圖2 老化對大豆種子MDA含量的影響

圖3 老化對大豆種子4-HNE含量的影響

2.4 4-HNE免疫組化染色結果

以吸脹20 h的胚軸為材料，采用免疫組化染色的方法，檢測老化過程中4-HNE積累的組織表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，隨著種子活力下降，切片的染色強度加深且面積擴大(圖4)。相比未老化種子，人工老化至萌發(fā)率為80%、50%和7%種子切片染色強度分別增加了50.1%、122.7%和212.1%；但自然老化至萌發(fā)率為80%種子的切片染色強度明顯高于50%萌發(fā)率的種子(圖4)，也顯著高于萌發(fā)率為80%的人工老化種子。該結果與圖3的4-HNE在不同處理之間的含量差異存在明顯的非相關性，其原因有待進一步分析。

圖4 人工老化和自然老化的大豆種子胚4-HNE免疫組化染色結果

2.5 種子老化過程中4-HNE代謝相關基因表達分析

參與4-HNE合成的代謝途徑有4類酶12個基因，參與其清除的代謝途徑有4類酶17個基因。轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，與未老化的種子相比，隨著老化時間的延長，差異表達的基因數(shù)量逐漸增加(表2)。對4-HNE代謝途徑相關基因的分析發(fā)現(xiàn)，相同基因在不同老化方式老化至相同萌發(fā)率水平的種子中表達模式不同(表3)，說明不同老化方式處理的種子中4-HNE的代謝可能存在差異。

為了驗證轉錄組結果，結合NCBI數(shù)據(jù)庫設計引物，檢測了4-HNE的合成和代謝相關的29個基因的表達量。結果發(fā)現(xiàn),老化誘導了4-HNE的合成，同時啟動清除機制的加強，說明老化影響了4-HNE合成和清除的酶系統(tǒng)。

表2 大豆種子中4-HNE合成和清除相關的差異表達基因轉錄本的比較

Group1_VS_Group2基因數(shù)/個差異基因數(shù)/個上調數(shù)/個下調節(jié)數(shù)/個CK_VS_AA8059000CK_VS_AA5055312CK_VS_AA764251312CK_VS_NA8054523CK_VS_NA5053943CK_VS_NA45918108

注：CK為未老化的種子；AA為人工老化；NA為自然老化；萌發(fā)率分別為80%、50%、7%、4%。

對比2種老化方式種子發(fā)現(xiàn)，4-HNE合成途徑中萌發(fā)率為80%和50%的種子表達顯著上升的基因，在人工老化中分別有5個和7個，在自然老化中分別有4個和7個。LOC100800915和LOC106794499基因在人工老化至種子萌發(fā)率為7%時，在自然老化老化至種子萌發(fā)率為80%時表達量顯著上升；LOX1.2，LOX1.3和LOC100813066基因在人工老化至種子萌發(fā)率7%時，自然老化至種子萌發(fā)率50%表達量顯著上升(圖5 A和圖6 A)。4-HNE清除代謝途徑中LOC100800668、LOC100783858、LOC100811186、LOC100782019、GLYMA11G06381、GLYMA17G01110、GLYMA19G32880、GLYMA15G40260和GLYMA07G16830等 9個基因在人工老化種子至萌發(fā)率80%時表達顯著上升，LOC100783318、LOC100800668、LOC100811501、LOC10072019、GLYMA19G32880、GLYMA03G29950和GLYMA07G16830等7個基因在自然老化種子至萌發(fā)率80%時表達顯著上升，其中LOC100800668、LOC100782019、GLYMA19G32880和GLYMA07G16830等4個基因在人工老化和自然老化種子中表達模式相近，人工老化比自然老化表達量大約2倍有3個，人工老化比自然老化表達量大約3倍有4個；人工老化種子中有16個基因在萌發(fā)率為50%時表達顯著上升，自然老化只有14個，其中人工老化比自然老化表達量大約2倍有3個，說明自然老化萌發(fā)率為80%和50%種子4-HNE清除能力比人工老化弱。清除相關酶的差異更明顯，萌發(fā)率為80%和50%時，alcohol-dehydrogenase和glutathiones-transferase在人工老化種子表達大于自然老化，尤其是glutathiones-transferase在人工老化種子表達是自然老化約2倍。cytochrome P 450在人工老化萌發(fā)率80%種子表達是自然老化約2倍。aldehyde dehydrogenase在自然老化中略高(圖5 B和圖6 B)。說明老化方式影響了4-HNE合成和清除的酶系統(tǒng)(見圖5和圖6)。

表3 與4-HNE合成和清除代謝相關的調控基因

途徑酶基因ID 基因名稱 基因功能變化模式人工老化自然老化合成15-脂氧合酶glyma13g347600LOX1.1種子亞油酸13S-脂氧合酶-1↓↑氫過氧化物裂解酶glyma11g122700LOC100810890 類9二乙烯醚合酶↓↑烯醛加氧酶glyma15g026300LOX1.3 脂氧合酶-3↑↓↑↓環(huán)化酶glyma09g124200LOC100800915可能的環(huán)化酶4↓↓glyma09g124700LOC106794499可能的環(huán)化酶4↑↓↓glyma19g247500LOC100813066 脂氧合酶-2↑↓清除醇脫氫酶glyma14g121200LOC100800668類醇脫氫酶1↑↓↓glyma04g240800LOC100783858 ADH2醇脫氫酶家族蛋白質↓↑醛脫氫酶glyma15g178400LOC100811186家族7成員A1↓↑細胞色素P450glyma17g007200GLYMA17G01110類細胞色素P450 71D8↑↓↑↓glyma19g146800GLYMA19G32880 類3,9-二羥基紫檀酸6A單加氧酶↑↑↓glyma03g143700GLYMA03G29950類細胞色素P450 93A1↓—glyma07g052300GLYMA07G05820 細胞色素P450 78A3↓↑谷胱甘肽轉移酶glyma07g139700GLYMA07G16810可能的谷胱甘肽S轉移酶↑↓↓glyma07g139800GLYMA07G16830可能的谷胱甘肽S轉移酶—↑

注：“↑”，上調；“↓”，下調；↑↓，上調和下調；“—”，沒有差異。

3 討 論

3.1 老化處理加劇了大豆脂質過氧化和基因表達差異

大豆是高蛋白、高油分種子，膜脂中高含量脂肪酸很容易發(fā)生過氧化作用產(chǎn)生活躍的自由基而造成膜的損傷，使細胞正常生理活動受到抑制[13-14]。本研究的結果表明，隨著種子老化，其浸泡液相對電導率逐漸增加(圖1)，表明老化破壞了大豆胚軸細胞膜結構，這與董發(fā)才[15]的結果一致。MDA是衡量種子老化過程中脂質過氧化程度的一個重要指標[16]，4-HNE則是生物活性最高的脂質過氧化產(chǎn)物[3]。研究表明，老化導致MDA和4-HNE的含量上升，但MDA含量變化不如4-HNE顯著，說明可能4-HNE與種子老化和脂質過氧化損傷關系更為密切[4]。轉錄組表明，隨著老化時間的延長，4-HNE代謝相關基因表達差異越大。LOX1.4，LOC100306686基因在人工老化和自然老化種子中的表達均隨種子活力下降而下降，說明老化后這2個基因的表達可能被抑制；另一方面，種子老化后4-HNE合成和清除大多數(shù)基因均隨萌發(fā)率降低而表達量上升，老化影響了4-HNE合成和清除的酶系統(tǒng)。

3.2 人工老化和自然老化對大豆種子中MDA和4-HNE含量的影響存在差異

研究表明，人工老化與自然條件下老化的機制是一致的，只是劣變的速度大大提高了[14,17-24]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，浸泡24 h的自然老化種子比相同萌發(fā)率的人工老化種子的相對電導率高，表明自然老化細胞膜完整性受損更嚴重，與李穩(wěn)香等[25]的研究結果不同。相同萌發(fā)率的人工老化種子和自然老化種子中MDA含量沒明顯差異；但4-HNE含量在萌發(fā)率為50%和80%的人工老化種子高于自然老化種子，說明人工老化與自然老化種子中4-HNE的形成和清除機制可能存在差異。

4 結 論

大豆-種子老化過程中發(fā)生脂質過氧化，導致MDA和4-HNE等小分子醛類物質積累，膜完整性破壞，相對電導率上升，這些皆可作為大豆種子老化的指標。人工老化引起的脂質過氧化損傷程度大于自然老化，自然老化種子的吸脹修復能力小于人工老化種子。老化和不同老化方式都對4-HNE合成和清除酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響，導致4-HNE在老化至不同萌發(fā)率水平和不同老化處理至同一萌發(fā)率水平的種子中積累存在差異。