應用中性粒細胞遷移距離推斷損傷時間

劉起清，郭紅民，王磊，魯翰霖，杜秋香，百茹峰，孫俊紅，王英元

（1.山西醫科大學法醫學院，山西 太原 030001；2.太原市公安局迎澤分局，山西 太原 030002；3.中國政法大學刑事司法學院，北京 100040）

損傷時間推斷是法醫病理學的難點問題之一，其研究方法主要包括形態學、分子生物學等，其中形態學方法具有確鑿、穩定、直觀可視化等優點。形態分析技術的不斷發展，陽性識別和計數，面積分析以及距離分析等功能的豐富，使得形態學分析（包括HE染色、免疫組織化學染色、免疫熒光染色及針對特定細胞的特殊染色等）進行骨骼肌損傷時間推斷的研究有了更廣闊的前景。

中性粒細胞是組織損傷后早期炎癥階段的重要參與者。損傷早期，在受損部位炎癥因子的趨化作用下，中性粒細胞迅速浸潤到損傷區，吞噬和清除壞死組織，從而為損傷區組織修復和再生創造條件[1]。因此，中性粒細胞對于早期損傷時間推斷具有重要研究價值。

髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）由中性粒細胞特異性合成和分泌，是中性粒細胞的特異性標志物[2-3]。目前中性粒細胞用于損傷時間推斷的研究主要集中在炎癥細胞數量及比例的時序性變化規律[4]。

本研究通過免疫組織化學染色技術標記MPO以特異性識別中性粒細胞，對中性粒細胞在骨骼肌損傷后的浸潤過程進行定性、定位、定量分析，同時應用組織細胞定量分析系統，檢測中性粒細胞在早期炎癥階段的遷移距離，并探討遷移距離在骨骼肌損傷時間推斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

自由落體肌肉挫傷裝置[5-7]。水合氯醛（天津科密歐化學試劑有限公司），一抗為兔抗MPO多克隆抗體（ab9535，英國Abcam公司），二抗使用即用型SABCPOD（小鼠/兔IgG）試劑盒（SA1020，武漢博士德生物工程有限公司），金屬增強型二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（AR1026，武漢博士德生物工程有限公司），蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（AR1180，武漢博士德生物工程有限公司），RM2135石蠟切片機（德國Leica公司），TissueFAXS PLUS免疫組織化學分析軟件（奧地利Tissue Gnostics公司），4%多聚甲醛溶液、無水乙醇、二甲苯、石蠟均為國產。

1.2 損傷模型制備

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠20只（購自北京海淀興旺實驗動物養殖場），體質量180～220 g，10～12周齡。將大鼠隨機分成對照組和損傷后2、4、6h組，每組5只。損傷組用10%水合氯醛溶液腹腔注射（0.35mL/100g）麻醉大鼠，運用500g重力錘從30cm高的位置以自由落體方式砸擊大鼠右后肢骨骼肌，打擊面積為6.15cm2（r≈1.40cm），重力勢能轉化得到的動能為1.5J。對照組麻醉方式同損傷組，但不進行打擊[4-5]。損傷后2、4、6h再次以上述方式麻醉大鼠，生理鹽水心臟灌注，取挫傷處骨骼肌并觀察其形態變化。

本動物實驗方法已獲山西醫科大學科學研究倫理審查委員會批準（倫理審批序號：2016LL151）。

1.3 免疫組織化學染色

將骨骼肌樣本置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟完畢后石蠟包埋制成蠟塊。使用RM2135石蠟切片機連續切片，厚度3～5 μm，防脫片玻片鋪片后60℃過夜。組織切片常規脫蠟至水，過氧化氫消除內源性酶，微波加熱修復抗原，5%小牛血清封閉，一抗4℃過夜，即用型SABCPOD二抗孵育，滴加鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物（streptavidin-biotin-peroxidase complex，SABC）液（二抗試劑盒內組分），DAB顯色試劑盒顯色，HE染色試劑盒復染；梯度乙醇脫水、透明、封片。

1.4 篩選有效細胞核并計數中性粒細胞

利用TissueFAXS PLUS軟件獲取組織切片高清圖片。每個時間點5個樣本，每個樣本隨機選取5張玻片，在每張玻片的損傷區內隨機選擇5個1mm×1mm分析區，即得到125個樣本數據。利用TissueFAXS PLUS軟件以蘇木素著色強度和著色面積作為參數識別細胞核。實驗中設置不同的核面積參數，逐步優化細胞核識別數量，使肉眼可見的細胞核數量識別率達95%以上，并以細胞核數量作為有效細胞核數量，有效細胞核包括骨骼肌細胞核和中性粒細胞核（標識為綠色）。同理，利用TissueFSXS PLUS軟件以DAB顯色強度和著色面積作為參數識別中性粒細胞（標識為紅色）。根據上述結果，系統將自動計數測量區域內的有效細胞核及中性粒細胞數并計算中性粒細胞比例。

1.5 中性粒細胞遷移距離測量

本研究提出基于組織切片計算中性粒細胞至最鄰近血管距離的“中性粒細胞遷移距離”簡化模型，測量中性粒細胞的平面平均遷移距離，而不考慮其到達損傷區的中間路程。具體測量方法如下：

在選擇的分析區內若只有一根血管，則以該血管為原點，檢測中性粒細胞與血管間的平面距離作為中性粒細胞的平面距離。若損傷區內有多個血管，可利用分析軟件計算每個中性粒細胞分別距離這些血管的平面距離，得到每個中性粒細胞的多個距離，此時以最短距離作為該中性粒細胞的平面距離。最后計算5個樣本所有中性粒細胞的平均平面距離作為該損傷時間點的推斷特征。

1.6 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，利用單因素方差分析比較各組中性粒細胞數及遷移距離的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 大體觀察及HE染色結果

對照組在解剖分離時肉眼可見骨骼肌和皮膚界限較清晰、易分離；鏡下見骨骼肌組織排列致密，肌細胞為多核細胞，胞核位于胞膜下，胞質著色鮮紅。與對照組相比，損傷后2～6h肉眼可見損傷處骨骼肌腫脹明顯，水腫和出血嚴重，骨骼肌與周圍皮膚粘連；鏡下見損傷區組織松散，骨骼肌間質內可見血管充盈，中性粒細胞向損傷區遷移，部分血管斷裂，骨骼肌細胞排列紊亂，細胞破裂，胞核碎裂、溶解，胞質內及細胞周圍可見炎癥細胞浸潤。

2.2 有效細胞核和中性粒細胞實際陽性率

從圖1可知，對照組組織切片中可見大量蘇木素著色的骨骼肌細胞核，通過軟件設置，骨骼肌細胞核被標識為綠色。損傷后2～6 h，損傷區的中性粒細胞（紅色標識）浸潤明顯，傷后2h中性粒細胞較少，傷后4h最多，傷后6h又減少。

TissueFAXS PLUS軟件統計有效細胞核和中性粒細胞結果（圖2）顯示：對照組有效細胞核的比例為（84.54±6.33）%，損傷后2～6 h，分析區內有效細胞核比例明顯下降，傷后2h為（74.87±6.06）%，傷后4h為（71.05±2.04）%，傷后6 h為（51.11±4.68）%。對細胞核進行分析，可見核面積小于42μm2的細胞在對照組中的比例為（15.45±3.12）%，傷后2 h比例為（25.09±3.43）%，傷后4h比例為（28.45±2.02）%，傷后6h比例為（41.97±0.63）%。傷后6h組中，僅蘇木素染色強度低于對照組的比例為（7.92±0.91）%，僅核面積小于對照組的比例為（23.09±1.50）%，染色強度低且核面積小的比例為（17.88±1.37）%。

對照組分析區內的中性粒細胞比例僅為（2.50±1.04）%，傷后2h上升至（13.50±1.25）%，傷后4h達到峰值（31.12±2.29）%，傷后6h下降至（14.13±1.42）%。

圖1 大鼠骨骼肌組織的MPO免疫組織化學染色結果（×200）

圖2 大鼠骨骼肌損傷后有效細胞核和中性粒細胞比例的組織細胞定量分析結果

損傷區域單位面積內有效細胞核及中性粒細胞數量、比例如表1所示。結果表明，骨骼肌組織在未損傷時中性粒細胞極少，在本研究中比例僅為（4.43±0.68）%，但假陽性率使其實際比值有所增加。傷后2h出現中性粒細胞浸潤，陽性率為（28.75±0.94）%，之后數量進一步增加，在4 h達到峰值，比例為（45.50±3.63）%，隨著炎癥過程進展，中性粒細胞浸潤程度逐漸降低，至傷后6h其陽性率為（31.92±1.56）%。結合上述數據并劃分區間：損傷后2h中性粒細胞實際陽性率＜30%，傷后4 h陽性率＞40%，傷后6 h陽性率為30%～40%。

2.3 中性粒細胞遷移距離

從圖3可見，損傷后2～6 h，中性粒細胞逐漸向損傷區遷移：傷后2 h中性粒細胞平均遷移距離為（124.80±12.32）μm，傷后4 h為（229.03±21.45）μm，傷后6h為（335.04±16.75）μm，組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。平均遷移距離隨損傷時間呈現規律性變化。根據上述數據可劃分區間：損傷后2h中性粒細胞平均遷移距離＜200μm，傷后4h平均遷移距離為200～300μm，傷后6h平均遷移距離為300～400μm。

表1 大鼠骨骼肌損傷后有效細胞核和中性粒細胞數的變化 （n=5，±s）

表1 大鼠骨骼肌損傷后有效細胞核和中性粒細胞數的變化 （n=5，±s）

注：各組間數據兩兩比較，P均＜0.05

中性粒細胞實際陽性率/%4.43±0.68 28.75±0.94 45.50±3.63 31.92±1.56組別對照傷后2h傷后4h傷后6h有效細胞核數/（個/mm2）854.23±59.09 1277.40±102.44 1110.01±82.23 987.03±83.47中性粒細胞數/（個/mm2）38.39±5.46 366.20±38.35 506.77±22.51 312.42±20.13

圖3 大鼠骨骼肌損傷后中性粒細胞的有效遷移距離（MPO免疫組織化學染色×100）

3 討 論

挫傷是日常生活中最常見的一類機械性損傷，其損傷時間推斷是法醫病理學研究熱點和難點之一[8]。損傷時常伴隨骨骼肌挫傷，骨骼肌因不容易受外部環境污染、自溶較慢、患病率低、取材方便等，可作為研究損傷時間推斷的良好檢材[9]。骨骼肌挫傷后，局部可出現紅、腫、熱、痛和功能障礙。在炎癥反應的早期（24h內），中性粒細胞以阿米巴運動的方式首先從血管滲出,并在趨化因子的誘導下向損傷部位定向遷移。有研究[10]報道，骨骼肌損傷后3 h就可分泌血小板衍生因子、成纖維細胞生長因子，趨化中性粒細胞浸潤到骨骼肌損傷區，吞噬壞死組織。中性粒細胞具有活躍的吞噬功能，含有酸性磷酸酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和溶菌酶等，可消化分解吞噬的異物，自身也常壞死，成為膿細胞；且中性粒細胞在靜息時就可發生凋亡，3d時凋亡率已達94.3%[11]。有研究[4]顯示，骨骼肌挫傷后6～12 h中性粒細胞浸潤明顯，傷后1 d浸潤程度降低，3d明顯降低，之后消失。本研究結果也顯示,骨骼肌損傷后中性粒細胞陽性率呈現先升高后降低的趨勢，且在損傷后2～6h即發現中性粒細胞明顯浸潤，進一步明確了中性粒細胞浸潤時限。人體白細胞浸潤一般需要4～6h[12]，本研究發現，大鼠在肌肉挫傷后2h即有中性粒細胞浸潤，分析其原因可能為：（1）隨著檢測儀器和技術的進步，使得原先未被檢測到的中性粒細胞得以被檢測出來；（2）白細胞浸潤時間可能與種屬、組織類型、損傷類型、損傷程度等情況有關；（3）大鼠的繁殖能力比人類強、生長速度比人類快，損傷后炎癥反應速度可能更快，組織修復能力可能更強。

本研究注意到，與對照組相比，損傷后2～6 h有效細胞核的比例逐漸降低，而蘇木素著色面積小于42 μm2的細胞核逐漸增多。這可能與骨骼肌細胞損傷壞死后出現核固縮、核碎裂、核溶解過程有關，導致核面積減小。進一步分析發現，對于傷后6h，不僅蘇木素著色面積小于正常值的核增多，著色強度小于正常值的核也明顯增多，這說明核固縮、碎裂、溶解與細胞壞死導致蘇木素著色能力降低的雙重影響共同拉低了該時間點有效細胞核的比例。

中性粒細胞的滲出是一個隨時間推演呈現由近及遠的動態過程。事實上，這些細胞具體由哪根血管滲出無從知曉，但對損傷時間推斷而言并無影響。根據直線距離對中性粒細胞到達損傷區發揮功能有現實意義，我們提出“有效遷移距離”的簡化模型，探究其在損傷時間推斷上的應用價值。

隨著炎癥進程的發展，中性粒細胞從血管滲出并向壞死部位定向趨化移動。這種趨化移動表現出明顯的規律性，具體體現在炎癥早期中性粒細胞遷移距離隨時間的規律性變化，損傷后2～6h中性粒細胞平均遷移距離隨損傷時間延長不斷增加，其吞噬和清除壞死組織的效能隨遷移距離逐漸延伸。損傷后2～6h中性粒細胞平均遷移距離隨損傷時間的規律性變化，有望用于骨骼肌損傷時間推斷的研究，為后續實驗提供了新型研究方法。

骨骼肌損傷部位是相對局限的范圍，中性粒細胞滲出后發揮效能的區域也應該是以損傷區為主，因此，中性粒細胞在到達目的區域后即停止游走，遷移距離可能不再隨損傷時間延長繼續增加。基于此種設想，“有效遷移距離”在早期損傷時間推斷上具有應用價值，而在晚期損傷時間推斷上可能意義不大。后續實驗將至少增加損傷后12、24、48h等時間點以豐富早期損傷時間中性粒細胞陽性率和有效遷移距離的數據，優化早期損傷時間推斷的時間窗口。本研究發現，中性粒細胞陽性率和有效遷移距離在損傷后2～6 h均呈現規律性變化，且組間差異具有統計學意義，同時結合兩者可能更有利于提高損傷時間推斷的準確性。當中性粒細胞陽性率＜30%、平均遷移距離＜200μm時，提示大鼠骨骼肌損傷后2h；當中性粒細胞陽性率＞40%、平均遷移距離為200～300 μm時，提示大鼠骨骼肌損傷后4 h；當中性粒細胞陽性率為30%～40%、平均遷移距離為300～400 μm時，提示大鼠骨骼肌損傷后6h。