及己根、莖、葉醇提取物的心臟毒性和毒性機制

孫淑萍 ，李紅星 ，張小平 ，馬云飛 ，楊梅

（1.皖南醫學院藥學院，安徽 蕪湖 241002；2.安徽師范大學生命科學院，安徽 蕪湖 241000；3.皖南醫學院天然日化研究所，安徽 蕪湖 241002）

及 己［Chloranthusserratus（Thunb.） Roem et Schult］為 金 粟 蘭 科（Chloranthaceae）金 粟 蘭 屬（Chloranthus Sw.）植物，以根或全草入藥，味苦，性平，具有活血散瘀的功效，主治跌打損傷、瘡疥、癤腫等癥[1]。及己全草有毒，曾出現服用及己劑量過大而致人中毒死亡的案例，尸體檢驗發現心臟表面有大量出血點，心臟組織病理學檢驗發現灶性炎癥細胞浸潤，心肌酶譜異常升高[2-3]。目前國內外對及己的研究較少，且局限于種類鑒別及化學成分等[4]，但其在應用中產生的毒性問題應引起足夠重視。雖然目前對及己的毒性已有部分研究，但心臟毒性僅在臨床病例有所報道[3]。本研究擬通過對染毒大鼠血清中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、α-羥丁酸脫氫酶（α-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH）以及心臟勻漿中氧化應激指標總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的測定，通過HE染色觀察大鼠心臟的組織病理學改變，免疫組織化學法檢測心肌組織中細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的陽性表達，Western印跡法檢測心肌組織中血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的蛋白表達，考察及己根、莖、葉各部位醇提取物對大鼠心臟毒性的差異，并初步探討其毒性機制，以期為今后及己的中毒診斷、治療及臨床合理應用提供參考，為法醫學鑒定提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究使用的及己產于廣西玉林，洗凈后自然晾干，分離出根、莖、葉，常溫保存。

1.2 實驗動物

健康雄性SD大鼠32只，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場，體質量（200±10）g，進食、飲水和活動正常。本研究經皖南醫學院藥學院實驗動物福利與倫理審查委員會認定符合要求。

1.3 主要試劑

蘇木素-伊紅染色液（無錫市江原實業技貿總公司），烏拉坦（天津市百世化工有限公司），羧甲基纖維素鈉（山東濰坊力特復合材料有限公司），CK、CK-MB、LDH、α-HBDH、T-SOD、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白濃度測定試劑盒、BeyoECL plus化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），增強型RIPA裂解液、鼠抗β-Actin、羊抗鼠IgG、兔抗HO-1、羊抗兔IgG、即用型SABC-POD（兔IgG）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜（美國Pall公司），彩色預染蛋白marker（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 及己根、莖、葉醇提取物的制備

將及己根粉碎至粗粉，用75%乙醇溶液回流提取3次：第1次為15倍量醇，浸泡0.5h，提取1.5h；第2次為10倍量醇，提取1 h；第3次為8倍量醇，提取1 h。每次抽濾，合并3次的濾液，減壓回收乙醇，45℃真空干燥，粉碎過80目篩，得及己根醇提取物。用75%醇提取物質量/粗粉質量×100%，即得75%醇提取物得率。

及己莖醇提取物與葉醇提取物制備方法同上。

于室溫干燥器中保存各部位醇提取物，備用。

1.4.2 動物分組與給藥

將32只大鼠隨機分為空白組、根醇組、莖醇組和葉醇組，每組8只。各組大鼠飼養于通風良好的動物房中，自由攝食飲水。適應性飼養1周后，分別取一定質量的及己根、莖、葉醇提取物和0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液，根據預實驗結果和種屬間等效劑量折算表[5]，確定大鼠日給藥量（g/kg）［給藥量（g）=3 g（人日服用量）×0.018×5×及己部位提取率（根醇提取物為15.35%，莖醇提取物為11.90%，葉醇提取物為4.31%）×100］。按前述的組別灌胃給予各部位醇提取物的羧甲基纖維素鈉混懸液，每日給藥1次，連續給藥14d?？瞻捉M給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。于第15日處死大鼠。

1.4.3 觀察大鼠生長情況

每天觀察并記錄大鼠活動、飲食量、眼角、皮毛、大小便等基本情況，并分別于第1、3、5、7、9、11、13、15天稱量每組大鼠體質量，計算體質量變化率［體質量變化率（%）=（稱得的體質量-第1天體質量）/第1天體質量×100%］，繪制其體質量變化曲線。

1.4.4 血清及心臟標本的采集

大鼠于末次灌胃后24h（后12h禁食不禁水），按照0.4mL/100g腹腔注射25%烏拉坦溶液進行麻醉，摘除眼球取血，于4℃下，以離心半徑6.8 cm，3 000 r/min，離心10min，取上清液即為血清，-80℃保存備用。

頸椎脫臼處死大鼠后立即解剖，觀察各組大鼠心臟及其他器官情況，進行記錄。分離出心臟，用預冷的生理鹽水清洗，濾紙吸干水分，分析天平稱質量，計算心臟系數［心臟系數（%）=（心臟質量/大鼠質量）×100%］，后將心臟放入-80℃冰箱中保存。

1.4.5 血清生物化學指標的測定

分別按照對應指標試劑盒說明書測定血清中CK、CK-MB、LDH和α-HBDH的含量。

1.4.6 氧化應激指標的測定

精密稱取心臟組織100mg，按心臟組織質量（g）∶生理鹽水（mL）=1∶9的比例加入預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），在冰水浴中研磨組織，制成的勻漿于4℃下，以離心半徑6.8cm，2500r/min，離心10min，吸取上清液測定MDA的含量。同時取一定量上清液用PBS稀釋成0.5%勻漿上清液，之后進行T-SOD含量的測定。測定操作參考試劑盒說明書。

1.4.7 HE染色與組織病理學觀察

將心臟從-80℃冰箱中取出，4℃復溫，置于10%甲醛溶液中固定，取材，石蠟包埋，常規制作組織切片行HE染色，對心臟組織進行組織病理學觀察與分析。

1.4.8 免疫組織化學法檢測ICAM-1的表達水平

將制備的心臟組織蠟塊制片，經60℃烘片1h后二甲苯脫蠟10min，乙醇復水后自來水沖洗5min，用枸櫞酸溶液加熱進行抗原修復，滴加過氧化氫室溫孵育20 min，血清封閉1 h，滴加一抗，放于濕盒中，4℃孵育過夜，次日洗凈，滴加二抗，室溫孵育30 min，滴加鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物（streptavidin-biotin-peroxidase complex，SABC），洗凈滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，自來水沖洗后蘇木素染核5min，流水沖洗，用0.25%氨水溶液返藍5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。用Image J軟件統計陽性表達百分比并定量分析。

1.4.9 Western印跡法檢測HO-1的蛋白水平

精密稱取心臟組織100mg，加入250μL RIPA裂解液［含苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）］于冰上勻漿30min后，于4℃下，以離心半徑6.8cm，12000r/min，離心10min，取上清液，經BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白濃度后，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃變性10 min。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，先80V電泳30min，再110V電泳至底部。電泳結束后，使用NC膜，110V轉膜70min，牛奶封閉2h，洗凈，4℃下一抗兔抗 HO-1（1∶400）或一抗鼠抗β-actin（1∶400）孵育過夜，洗凈孵育二抗羊抗兔IgG（1∶6000）或二抗羊抗鼠IgG（1∶8000）1.5h，洗膜后滴加現配的增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影液曝光顯影。用Image J軟件讀取灰度值，計算HO-1與內參β-actin的灰度值比值并定量分析。

1.5 統計學處理

實驗結果采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，多個樣本均數間的比較采用完全隨機設計的方差分析（analysis of variance，ANOVA）進行分析，數據均以±s形式表示，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 給藥后各組大鼠的一般情況及解剖情況

各組大鼠分別灌胃相應的混懸液后，飼養在通風良好的動物房中，每天觀察大鼠的一般情況，將大鼠解剖后觀察重要器官的大體情況，結果見表1。

表1 各組大鼠一般情況及解剖情況

2.2 對大鼠體質量的影響

與空白組相比，莖醇組和葉醇組大鼠體質量增長率均較小，相對而言，莖醇組大鼠體質量增長率低于葉醇組，而根醇組大鼠體質量增長率高于空白組，詳見圖1。

2.3 對大鼠心臟系數的影響

在空白組、根醇組、莖醇組和葉醇組4組之間，大鼠心臟系數的差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

圖1 各組大鼠體質量隨時間的變化曲線

表2 各組大鼠心臟系數（n=8，±s，%）

表2 各組大鼠心臟系數（n=8，±s，%）

心臟系數0.32±0.03 0.31±0.01 0.31±0.01 0.31±0.01組別空白根醇莖醇葉醇

2.4 對大鼠血清生物化學指標的影響

與空白組相比，根醇組和葉醇組中CK、CK-MB、LDH、α-HBDH含量差異均無統計學意義（P＞0.05），而莖醇組各指標均升高（P＜0.05）。與根醇組相比，葉醇組各指標差異均無統計學意義（P＞0.05），莖醇組CK、LDH、α-HBDH 均升高（P＜0.05）。與莖醇組相比，葉醇組CK、LDH、α-HBDH均降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.5 對大鼠氧化應激指標的影響

與空白組相比，根醇組的MDA和T-SOD含量差異無統計學意義（P＞0.05）；莖醇組 MDA 升高（P＜0.05），T-SOD降低（P＜0.05）；葉醇組T-SOD降低（P＜0.05）。和根醇組相比，莖醇組兩個指標差異均有統計學意義（P＜0.05），葉醇組兩個指標差異均無統計學意義（P＞0.05）；與莖醇組相比，葉醇組兩個指標差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表4。

表3 各組大鼠血清生物化學指標 （n=8，±s，U/L）

表3 各組大鼠血清生物化學指標 （n=8，±s，U/L）

注：1）與空白組相比，P＜0.05；2）與根醇組相比，P＜0.05；3）與莖醇組相比，P＜0.05

α-HBDH 245.00±40.00 261.70±52.10 452.30±61.401）2）266.80±65.803）組別空白根醇莖醇葉醇CK 2490.70±437.30 2552.20±665.80 4284.50±595.101）2）2788.40±518.403）CK-MB 1422.00±104.00 1671.80±165.80 2171.50±122.901）1733.30±164.90 LDH 573.00±110.00 633.80±138.30 990.00±196.601）2）660.30±102.203）

表4 各組大鼠心臟勻漿MDA、T-SOD含量（n=8，±s）

表4 各組大鼠心臟勻漿MDA、T-SOD含量（n=8，±s）

注：1）與空白組相比，P＜0.05；2）與根醇組相比，P＜0.05；3）與莖醇組相比，P＜0.05

T-SOD/（U·mg-1）127.50±7.70 115.00±12.30 86.00±5.001）2）107.20±11.701）3）T-組別空白根醇莖醇葉醇MDA/（nmol·mg-1）5.48±0.28 5.87±0.04 8.43±0.371）2）5.75±0.483）

2.6 對大鼠心肌組織形態的影響

空白組心肌纖維排列整齊、橫紋清晰，心肌細胞結構完整，細胞核與細胞質清晰。根醇組心肌細胞未見明顯的壞死、水腫、淤血和萎縮等病理變化，偶見心肌纖維間小血管輕微擴張、充血。莖醇組心肌組織結構與細胞結構破壞，心肌纖維出現斷裂且排列紊亂，呈波浪形，心肌間質血管擴張、破裂，淤血現象明顯，有水腫液淤積，心肌細胞排列紊亂，間距增大，部分細胞核固縮或消失。葉醇組局部小血管擴張、充血和水腫。詳見圖2。

2.7 對ICAM-1表達水平的影響

與空白組和根醇組相比，莖醇組和葉醇組ICAM-1陽性表達均升高（P＜0.05），且莖醇組高于葉醇組（P＜0.05），詳見圖3和表5。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學改變（HE×200）

圖3 各組大鼠心臟組織ICAM-1免疫組織化學染色結果（×200）

表5 各組大鼠ICAM-1陽性表達情況（n=8，±s，%）

表5 各組大鼠ICAM-1陽性表達情況（n=8，±s，%）

注：1）與空白組相比，P＜0.05；2）與根醇組相比，P＜0.05；3）與莖醇組相比，P＜0.05

ICAM-1陽性0.97±0.22 3.00±0.44 35.53±4.981）2）13.93±4.961）2）3）組別空白根醇莖醇葉醇

2.8 對HO-1蛋白表達的影響

與空白組相比，根醇組、莖醇組和葉醇組心臟組織中HO-1蛋白表達均降低（P＜0.05）。與根醇組相比，莖醇組和葉醇組心臟組織中HO-1蛋白表達降低（P＜0.05）。與莖醇組相比，葉醇組HO-1蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖4和表6。

圖4 各組大鼠HO-1蛋白表達情況

表6 各組大鼠HO-1蛋白表達情況（n=8，±s）

表6 各組大鼠HO-1蛋白表達情況（n=8，±s）

注：1）與空白組相比，P＜0.05；2）與根醇組相比，P＜0.05

HO-1相對表達量2.10±0.22 1.11±0.611）0.87±0.031）2）0.89±0.051）2）組別空白根醇莖醇葉醇

3 討 論

現代藥理研究[6]表明，部分中藥心臟毒性問題突出，會破壞心肌微結構，造成心肌損害，引起細胞凋亡、組織損傷、心律失常和心肌酶升高等，因此，進行藥物的臨床前心臟毒性安全性考察、評價及預測是十分必要的，也是臨床安全合理用藥的需求所在。

本實驗中各組大鼠用藥后，均出現活動量減少，精神不佳等癥狀，解剖見組織淤血等，表明及己根、莖、葉醇提取物均具有毒性。莖醇組和葉醇組大鼠體質量增長率的減小表明兩者均具有毒性作用且莖醇提取物毒性較大。而根醇組大鼠體質量增長率較空白組高，可能與根醇提取物中含有營養成分及其毒性較小有關。

心肌酶主要存在于心臟等組織中，當心肌細胞受損時，會引起心肌酶從心肌細胞中溢出到血清中，使血清中心肌酶含量異常升高。因此，可以用心肌酶的變化來反映心肌損傷程度以及病灶的大小，特別是CK-MB，被認為是各種形式心臟損傷的標準診斷參數[7]。此外，CK、LDH和α-HBDH也是反映心臟毒性的常見指標[8]。本研究結果顯示：與空白組相比，根醇組、莖醇組、葉醇組心肌酶含量均出現不同程度升高，表明藥物組心肌酶活性受到了不同程度的影響，心肌組織出現相應的損傷，其中莖醇組升高程度最明顯，說明莖醇提取物心臟毒性最大。結合組織病理學觀察可見莖醇組心肌結構嚴重損傷，淤血明顯，葉醇組局部血管擴張、充血和水腫，根醇組無明顯水腫和壞死。結合前述體質量變化情況，顯示莖醇提取物心臟毒性最大，其次為葉醇提取物。

活性氧的持續生成會導致氧化應激，SOD能消除O3-，減輕氧化損傷，可以反映抗氧化損傷能力[9]。MDA是脂質過氧化的穩定代謝產物，可以反映自由基脂質過氧化程度[10]。本研究結果顯示：根醇組、莖醇組、葉醇組中MDA含量均升高，且莖醇組升高程度明顯大于根醇組和葉醇組，同時三者中T-SOD含量也均降低，莖醇組中T-SOD含量降低最顯著，說明莖醇提取物毒性最大，刺激自由基大量產生，脂質過氧化反應加劇。

ICAM-1在炎癥反應等過程中發揮著重要作用，并廣泛表達于血管內皮細胞、炎癥細胞等細胞中。ICAM-1在正常細胞中呈低水平表達，病理狀態下ICAM-1能促進炎癥部位的黏連，使炎癥細胞與內皮細胞間的黏附性增強，故表達量也明顯增加。本研究結果顯示：各組ICAM-1陽性表達均增強，表明三者均有心臟毒性，其中莖醇組最明顯，其次是葉醇組，可提示莖醇提取物心臟毒性最大，其次為葉醇提取物。

HO-1是一種誘導應激反應酶，在與應激有關的病理生理狀態（如氧化應激損傷、炎癥反應）中具有重要的調節作用[11]。當機體受到病理損傷時，產生氧自由基，造成氧化應激反應，而HO-1參與自由基清除，導致其含量發生改變。因此，可以用HO-1蛋白表達變化來反映用藥后各組大鼠的心肌損傷程度。本研究結果顯示：根醇組、莖醇組和葉醇組心臟組織中HO-1表達較空白組均降低（P＜0.05），表明三者均具有心臟毒性，提示3組大鼠在給藥后心臟均受到了氧化應激損傷，其中莖醇組和葉醇組HO-1表達下降明顯，根醇組最小。

現有關及己的研究較少，研究者對及己的研究主要在其種類鑒別、化學成分和抗感染作用等方面[12-15]。本研究結果顯示：及己莖心臟毒性最大，其次為及己葉，及己根心臟毒性最小。本研究通過對及己不同部位心臟毒性的大小比較研究，為今后及己的中毒防治與合理開發應用提供了一定的理論支持。此外，及己所含的化學成分復雜，心臟毒性的作用機制也較復雜，目前實驗結果提示，及己根、莖、葉的毒性作用機制可能與激發氧化應激和刺激脂質過氧化物酶激活有關，具體的血流動力學相關參數及病理毒性作用機制有待今后進一步研究。發掘及己根、莖、葉各部位所致心臟毒性內在作用機制和分離其毒性成分，可為及己的中毒預防以及其在活血散瘀和跌打損傷等領域的應用提供參考，為法醫學鑒定提供依據，是下一步研究的主要方向之一。