芬太尼類化合物的質譜特征

（公安部禁毒情報技術中心 國家毒品實驗室，北京 100193）

芬太尼是高效阿片類鎮痛藥，動物實驗表明，芬太尼的鎮痛效力為嗎啡的50～100倍[1-3]，屬于強效麻醉性鎮痛藥，被譽為“鎮痛藥中的王牌”，其鎮痛作用產生快，但持續時間短暫，呼吸抑制作用較嗎啡弱，不良反應比嗎啡小[4-5]，現已經成為全球麻醉藥品增長最快的品種之一。近年來，由于芬太尼及其衍生物的高效力帶來嚴重不良反應且濫用致死的事件時有發生，引起了全球關注[6-8]。美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）、加拿大衛生部曾數次發布芬太尼安全性公告及警示信息[4]。

芬太尼類化合物因其簡單的合成工藝和極易獲得的前體原料、合成設備，在過去幾十年被大量地開發制造出來[9-16]，如阿芬太尼、舒芬太尼、瑞芬太尼、卡芬太尼等。最近出現的芬太尼類的新精神活性物質大多是通過修飾或取代芬太尼的丙酰鏈（如乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、奧芬太尼）或通過取代苯乙基部分（β-羥基硫代芬太尼）[17]，或進一步用氟、氯、甲氧基等取代N-苯環得到[18-19]，其藥效與芬太尼相似甚至更強。為逃避打擊，該類物質更新換代十分迅速，未管制的新型化合物可能隨時被合成并被濫用。

從2012年至2017年，本實驗室在對繳獲樣品的分析鑒定中，共發現9種芬太尼類化合物，即2，2’-二氟芬太尼（2，2’-difluorofentanyl）、乙酰芬太尼（acetylfentanyl）、芬太尼（fentanyl）、丁酰芬太尼（butyrylfentanyl）、戊酰芬太尼（valerylfentanyl）、丙烯酰芬太尼（acrylfentanyl）、呋喃芬太尼（furanylfentanyl）、4-氟異丁酰芬太尼（4-fluoroisobutyrfentanyl）和卡芬太尼（carfentanil）。這9種芬太尼類化合物具有相同的骨架結構，其取代基R1為直鏈烷基或呋喃基，取代基R2和R3為氫或氟取代，取代基R4為氫或甲氧羰基（圖1）。

圖1 9種芬太尼類化合物結構示意圖

本研究使用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight-mass spectrometry，UHPLC-QTOF-MS）和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對9種芬太尼類化合物進行分析，并對所獲得的質譜圖進行解析，總結該類物質在碰撞誘導解離（collision induced dissociation，CID）和電子轟擊電離（electron impact ionization，EI）時獲得的各種碎片離子與分子結構的關系，推測可能的碎裂途徑，并歸納通過譜圖推導未知芬太尼類化合物結構的方法，從而為該類物質的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TripleTOFTM5600液相色譜高分辨串聯質譜儀（美國AB Sciex公司），ACQUITY UPLC系統（美國Waters公司），GCMS-QP2010氣相色譜質譜聯用儀（日本島津公司），AvanceⅢ 400核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），Milli-Q? Advantage A10超純水系統（德國Merck公司），XP6電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），KQ-500E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2，2’-二氟芬太尼、乙酰芬太尼、芬太尼、丁酰芬太尼、戊酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、4-氟異丁酰芬太尼和卡芬太尼均來自各地公安機關送檢樣品，其結構已經過GC-MS、UHPLC-QTOF-MS、一維核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H NMR）和核磁共振碳譜（13C nuclear magnetic resonance spectroscopy，13C NMR），以及二維氫-氫相關譜（1H/1H-correlation spectroscopy，1H/1HCOSY）、碳-氫異核單量子相關譜（1H/13C-heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy，1H/13CHSQC）和多鍵碳氫關系譜（1H/13C-heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy，1H/13C-HMBC）確認。甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）購自德國Merck公司，乙腈（色譜純）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 UHPLC-QTOF-MS分析條件

色譜柱為ACQUITY UPLC CSHTMC18柱（100mm×2.1 mm，1.7 μm），購自美國Waters公司。柱溫40℃，流速0.4 mL/min，進樣體積為1 μL，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式，離子源溫度600℃，噴霧電壓5500V，霧化器 50 psi，輔助加熱氣 50 psi，氣簾氣 30 psi，去簇電壓80 V。全掃描模式（MS1），掃描范圍（m/z）為100～1000；CID，子離子掃描模式（MS2），掃描范圍（m/z）為50～1000，碰撞能量35eV，擴展碰撞能量15eV，離子駐留時間100ms。

1.3 GC-MS分析條件

色譜柱為DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），購自美國Agilent公司。載氣為氦氣，流速1 mL/min；分流進樣，進樣量 1 μL，分流比 20∶1；進樣口溫度280℃。升溫程序：起始溫度270℃，保持17 min，以30℃/min升至300℃并保持5 min。EI模式，能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度250℃，掃描范圍（m/z）為35～500。

1.4 樣品處理

GC-MS分析：將5mg樣品溶于5mL甲醇中，超聲振蕩10min，經0.45μm濾膜過濾后進樣分析。

UHPLC-QTOF-MS分析：將配制的1 mg/mL樣品溶液用0.1%甲酸水溶液稀釋成1 μg/mL溶液，經0.22μm濾膜過濾后進樣分析。

2 結果與討論

2.1 9種芬太尼類化合物的色譜分離情況

9種芬太尼類化合物的分子式、相對分子質量、UHPLC-QTOF-MS及GC-MS分析時的保留時間如表2所示。從表中可以看出，各組分均得到了令人滿意的分離效果。根據色譜分離原理，分析物在反相C18固定相的UHPLC-QTOF-MS分析中，按極性由大到小的順序依次洗脫，而在弱極性DB-5MS固定相的GC-MS分析中，保留時間受到沸點、極性和π-π作用等多種因素的影響。乙酰芬太尼、芬太尼、丁酰芬太尼和戊酰芬太尼隨著直鏈烷基R1的增加，極性逐漸減小，沸點逐漸增加，因此在GC-MS和UHPLC-QTOFMS分析中的保留時間均依次延長。丙烯酰芬太尼與芬太尼相比極性增加，UHPLC-QTOF-MS分析保留時間減少，但分子中的雙鍵與DB-5MS固定相中的苯基存在π-π作用，因此GC-MS分析中保留時間延長。4-氟異丁酰芬太尼和2，2’-二氟芬太尼由于苯環氟代極性降低，且分子間色散力減小，沸點降低，因此與未取代的丁酰芬太尼和芬太尼相比，UHPLC-QTOFMS分析保留時間增加而GC-MS分析保留時間減少。而對于呋喃芬太尼和卡芬太尼，呋喃基和COOCH3基團的取代使分子極性降低，沸點升高，呈現UHPLCQTOF-MS和GC-MS分析保留時間與芬太尼相比均增加的情況。

2.2 9種芬太尼類化合物的ESI-CID質譜碎裂規律

9種芬太尼類化合物的二級質譜圖見圖2。從圖中可見，該類物質具有明顯的特征碎片離子，有利于對樣品進行結構鑒定或確證。

表2 9種芬太尼類化合物的分子式、相對分子質量及保留時間

圖2 9種芬太尼類化合物ESI模式下QTOF-MS的二級質譜圖

2.2.1 8種芬太尼類化合物的ESI-CID質譜碎裂規律

除卡芬太尼外，其他8種芬太尼類化合物由于結構相似，其ESI-CID質譜碎裂規律也相似，由準分子離子[M+H]+進行碰撞誘導裂解得到的主要碎片離子見表3（質量誤差均小于4×10-6），離子生成示意圖見圖3。

表3 8種芬太尼類化合物的ESI-CID碎裂途徑生成離子質荷比

圖3 芬太尼類化合物ESI-CID碎片離子的生成示意圖

特征碎片離子a在8種芬太尼類化合物的二級質譜圖中均為基峰，由哌啶環與N-苯基酰胺之間的碳氮鍵斷裂而形成（圖3A中碎裂途徑⑤）。準分子離子[M+H]+經碰撞誘導后，發生酰胺鍵斷裂，丟失烷基醛得到碎片離子b（圖3A中碎裂途徑⑥），碎片離子b中的哌啶環進一步碎裂，生成碎片離子c和d（圖3A中碎裂途徑④）。此外，準分子離子[M+H]+通過哌啶環的裂解或苯乙基鍵的斷裂分別得到碎片離子e、g（圖3A中碎裂途徑③和②）和碎片離子f（圖3A中碎裂途徑①）。呋喃芬太尼的R1為呋喃基，二級質譜圖（圖2G）中無碎片離子d和g，其余化合物均可見碎片離子 a、c、d、e、f和g。由于2，2’-二氟芬太尼的 R3是氟取代，所以除2，2’-二氟芬太尼外，其他7種芬太尼類化合物均有相同的碎片離子a（C13H18N+，m/z188.1434）、c（C10H12N+，m/z146.0964）、e（C9H12N+，m/z134.0964）和f（C8H9+，m/z105.0699）。

2.2.2 卡芬太尼的ESI-CID質譜碎裂規律

由于4-甲氧羰基的取代，卡芬太尼的ESI-CID質譜碎裂規律不同于其他8種芬太尼類化合物（圖2I、圖3C）。準分子離子[M+H]+丟失CH3O部分和COOCH3部分，分別得到碎片離子C23H27N2O2+（m/z363.207 2）和C22H27N2O+（m/z335.2117）。碎片離子C22H27N2O+通過進一步丟失C3H4O部分和裂解哌啶環，生成子離子C19H23N2+（m/z279.185 6）、C13H16NO+（m/z202.122 6）、C10H12N+（m/z146.096 6）和 C11H12N+（m/z158.096 3）。準分子離子[M+H]+還通過途徑⑤（圖3A）的碳氮鍵斷裂形成碎片離子 C15H20NO2+（m/z246.149 0），再進一步裂解哌啶環和丟失C2H4O2，得到離子C6H9O2+（m/z113.059 9）和C13H16N+（m/z186.127 6）。此外，通過碎裂途徑③和①（圖3A），分別形成碎片離子C9H12N+（m/z134.0964）和C8H9+（m/z105.0699）。

2.3 9種芬太尼類化合物的EI質譜碎裂規律

9種芬太尼類化合物的EI質譜圖具有很高的相似度（圖4），其主要碎片離子見表4。該類物質的EI質譜圖具有以下特點：（1）由于分子離子不穩定，圖上均未見分子離子峰；（2）碎片離子豐富，這使得該類物質的質譜圖特征信息豐富，有利于通過GC-MS對樣品進行結構鑒定或確證。

9種芬太尼類化合物的EI質譜碎裂規律見圖5，基峰離子均為碎片離子a或d。在電子的轟擊下，哌啶環N原子失去π電子形成游離基中心，誘導相鄰碳原子發生α斷裂而丟失卓鎓離子（M-91）形成特征離子a（圖5A），然后進一步發生N-苯基酰胺的解離，羰基與氨基之間化學鍵斷裂得到碎片離子b。特征離子d是先通過哌啶環的裂解得到碎片離子c，碎片離子c再進一步分離COR1部分最終形成碎片離子d（圖5B）。此外，通過COR1部分的分離和哌啶環的裂解還生成碎片離子e和f（圖5C）。哌啶環N原子與苯乙基間化學鍵發生斷裂形成碎片離子g（圖5D）。除卡芬太尼外，其余8種芬太尼類化合物的EI質譜圖中均明顯可見碎片離子a、c、e、f、g的離子峰。

卡芬太尼的EI質譜碎裂規律與其他芬太尼類化合物略有不同。在圖4I中，同樣能觀察到碎片離子a（m/z303）、e（m/z158）和g（m/z105）的離子峰。但是，由特征離子a丟失CO和COC2H4部分后，分別得到了碎片離子C16H23N2O2+（m/z275）和C15H19N2O+（m/z243）。

圖4 9種芬太尼類化合物EI模式下的質譜圖

表4 9種芬太尼類化合物的EI碎裂途徑生成離子質荷比

圖5 芬太尼類化合物EI碎片離子的生成示意圖

3 結 論

本研究解析了9種芬太尼類化合物UHPLCQTOF-MS和GC-MS所獲得的質譜圖，并對其CID和EI的特征碎裂規律進行了歸納和總結。研究結果表明，由于芬太尼類化合物具有相同的骨架和類似的分子結構，因而其CID和EI碎裂途徑也具有高度的相似性，在CID模式下，哌啶環與N-苯基酰胺之間的碳氮鍵、哌啶環內的碳氮鍵、苯乙基與哌啶環間的碳氮鍵易發生斷裂形成特征離子，而在EI模式下，哌啶環的裂解及哌啶環與苯乙基的斷裂為主要碎裂途徑。鑒于目前芬太尼類物質層出不窮，更多的芬太尼類化合物可能被合成和濫用。本研究總結的關于芬太尼類化合物在CID和EI模式下的主要碎裂途徑以及所形成的特征離子，將有助于法庭科學實驗室在實際工作中識別鑒定該類物質。