靜脈血栓形成時間推斷的法醫學研究進展

王林林 ，張富源 ，梁雪瑩 ，王昌亮 ，4，趙銳 ，官大威

（1.中國醫科大學法醫學院 法醫司法鑒定中心，遼寧 沈陽 110122；2.智慧檢務創新研究院 智慧司法鑒定聯合實驗室，遼寧 沈陽 110122；3.中國醫科大學臨床三系，遼寧 沈陽 110122；4.遼寧省人民檢察院，遼寧 沈陽 110032）

肺栓塞（pulmonary embolism，PE）是內源性或外源性栓子阻塞肺動脈引起肺循環障礙的一組疾病，包括肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）、脂肪栓塞綜合征、羊水栓塞、空氣栓塞、腫瘤栓塞等。PE中尤以來自靜脈系統或右心的血栓阻塞肺動脈導致的PTE最為常見，占PE的絕大多數，通常所稱的PE即為PTE[1]。深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是引起PTE的主要血栓來源，90%以上的DVT發生于下肢或者骨盆深靜脈[2]。鑒于DVT與PET在發病機制上的相互關聯性，臨床上將其統稱為靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）[1]。

PTE是常見猝死原因之一，其致死率為心血管系統疾病的第三位，僅次于冠心病和腦卒中[3]。近年來，國內外統計數據表明，PTE導致的猝死案例約占法醫學實踐中同期尸體檢驗案例總數的1%～5%[2，4-7]。對于PTE致死案例的法醫學鑒定，通過詳細的尸體解剖，在肺動脈及其分支內檢查到血栓，可在下肢、骨盆等深靜脈內追溯到血栓來源，結合案情及臨床資料，排除中毒及其他致死性疾病與損傷后，可以得出死亡原因鑒定意見[8-9]。真正的難題是對于一些機體受創傷后因PTE死亡，或是以非血栓相關疾病收治入院期間因PTE死亡的案例，需要法醫病理學工作者分析創傷或醫療行為與PTE發生之間的因果關系，以進行事故責任的認定[2，10]。要解決這一難題，需要認定創傷發生或醫療干預與血栓形成在時間上是否存在相關性。創傷或醫療干預的發生時間多有準確、客觀的記錄，因此，解決這一問題的關鍵就在于對血栓形成時間的準確判定上。本文就靜脈血栓形成時間的法醫學研究進展進行綜述，以期為相關案例的鑒定提供參考。

1 靜脈血栓形成時間推斷的理論基礎

血栓形成是血液在流動狀態下，由于血小板的活化和凝血因子激活而發生的異常凝固過程。1856年，德國生理學家VIRCHOW首次提出了血栓形成的三因素學說[11]：血流瘀滯、靜脈壁損傷及血液高凝狀態。外力作用致內皮損傷后，內皮下帶負電荷的膠原暴露，激活凝血因子Ⅻ而啟動內源性凝血進程。同時內皮下組織因子釋放，激活凝血因子Ⅶ而啟動外源性凝血進程[11]。近年來研究發現，免疫細胞介導的無菌性炎癥在靜脈血栓形成過程中發揮重要推動作用，并提出了免疫性血栓形成學說（immunothrombosis）[12]。當血管損傷或者血流瘀滯時，內皮細胞被激活，釋放Weibel-Palade小體，Weibel-Palade小體內儲存的血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和P選擇素（P-selectin）表達至內皮細胞表面。vWF可以黏附并激活血小板，血小板激活后釋放硫醇型高遷移率族B1（high mobility group B1，HMGB1）蛋白促進白細胞募集，募集而來的單核細胞通過P選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL1）與內皮細胞激活后釋放的P-選擇素作用結合至內皮細胞表面，隨后通過提供組織因子促進外源性凝血進程。中性粒細胞通過PSGL1與內皮細胞P選擇素結合后，釋放由DNA、組蛋白等構成的中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular trap，NET），NET中的DNA帶負電，可激活凝血因子Ⅻ促進內源性凝血進程。最終，在上述凝血調控機制作用下，凝血酶原被激活，產生的凝血酶使纖維蛋白原轉變為不可溶性纖維蛋白，與局部聚集的血小板、白細胞、紅細胞等共同構成血栓[13-16]。

血栓形成后，纖溶系統激活，血漿中的纖溶酶原在組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，tPA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）作用下發生有限水解而激活為纖溶酶。在纖溶酶作用下，纖維蛋白和纖維蛋白原被分解成可溶性小肽而促使血栓溶解。若纖溶系統的活力不足，血栓長時間不被溶解，則由內皮細胞、成纖維細胞自血管壁向血栓內長入，形成肉芽組織逐漸取代血栓，這一過程稱為血栓機化。血栓機化過程中，新生的內皮細胞覆蓋于血栓內由于組織干燥收縮產生的裂隙上，形成迷路狀相互溝通的管道，使血栓上下游的血流得以部分地溝通，這種現象稱為再通[17-19]。單核細胞在血栓溶解過程中發揮重要作用，可通過釋放uPA和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和多種炎癥因子等促進血栓溶解，并通過誘導內皮祖細胞募集促進血管新生[20-21]。

血栓的形成、溶解及機化再通是一個復雜的動態變化過程，需要多種效應細胞及其釋放的調節因子共同參與，這些活性成分的時序性表達與血栓形成時間具有相關性，是法醫學研究中進行靜脈血栓形成時間推斷的理論基礎。通過系統檢測這些活性成分的時序性表達規律，篩選出與靜脈血栓形成時間相關性好的生物學指標，并將相關研究成果應用于實踐，是解決靜脈血栓形成時間推斷這一科學問題的基本研究思路。

2 靜脈血栓形成時間推斷的早期研究成果

1922年，M?LLER[22]最先開始探討通過紅細胞形態學改變、含鐵血黃素沉積等現象推測血栓形成時間的可能性。20世紀中葉以后，IRNIGER等[23-26]相繼對PTE案例中的血栓形成時間進行了研究。其中尤以IRNIGER[23]的研究最為系統，具有重要的里程碑意義。IRNIGER通過將法醫學實踐中收集的血栓形成時間相對明確的143例PTE死亡案例，制作血栓組織切片后進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、Van Gieson染色、Weigert彈力纖維染色、網狀纖維嗜銀染色、Perls含鐵血黃素染色等，根據系統的形態學表現將血栓的形成時間劃分為6個階段（表1）。

表1 IRNIGER的血栓形成時間分期標準[23]

對于IRNIGER的研究成果，JANSSEN[27]認為其對血栓形成時間的階段劃分過于細致，在實際應用中需謹慎。SAUKKO等[28]綜合前人研究成果，在Knight’s Forensic Pathology第3版中對靜脈血栓形成時間推斷提出了以下建議：（1）血小板及紅細胞形態學表現難以提供有價值的信息。紅細胞可于血栓形成后24～48h開始溶解形成無定形團塊，但是也會有一些完整紅細胞存活數周之久。（2）進行磷鎢酸蘇木素染色，1d時纖維蛋白可被染成淡紫色條帶，4d時聚集成小團塊，表現為更粗的網狀條帶，2周后纖維蛋白被染成深紫色，25d時開始逐漸被吸收。進行馬休黃猩紅藍染色，早期被染成粉紅色的纖維蛋白條帶于1周左右開始被深紅色替代。（3）內皮細胞增殖是反映血栓形成1周內的最好指標，內皮細胞于2d時開始萌芽，并在第1周內持續增殖。血栓周邊緊靠靜脈壁的裂隙內可見內皮細胞覆蓋。這些新生的內皮細胞將血栓錨定在靜脈壁上，是血栓再通進程的第一步。這一現象通常在第4天時比較明顯。（4）膠原纖維在血栓形成后的5～10 d（甚至更長的時間）內都不會出現。成纖維細胞最早可于第2～3天開始出現，但多數于第1周后期開始出現，并于第2～4周達到高峰。彈力纖維于血栓形成28d以后才開始出現，于2個月左右達到高峰，主要分布于再通的血管壁內。（5）被Perls染液染成藍色的含鐵血黃素顆粒于血栓形成后第1周的后期開始出現，并在3周內達到高峰。（6）隨著內皮細胞的生長，最早于第2天時在血栓內就可觀察到毛細血管，但是直到2周后這些血管內才會有紅細胞填充。在隨后的3個月內，這些小的腔隙會匯合成為大的管腔。被堵塞的血管在第6～12個月會實現完全再通，但是內皮增厚及管壁內含鐵血黃素沉積可能會長期存在。（7）多核細胞可于1d內出現，隨后迅速消失，通常第2天時單核細胞就成為主要的白細胞成分。（8）血栓游離面被內皮細胞覆蓋的過程非常迅速，可能于第1天就開始并在24～72h結束。

3 靜脈血栓形成時間推斷的近期研究進展

20世紀80年代以后，免疫組織化學染色、多重免疫熒光等實驗技術手段發展迅速，EISENMENGER等[29]將此技術應用到法醫學領域，為損傷時間推斷的相關研究掀開了新的篇章。2009年，FINESCHI等和KONDO團隊幾乎同時發表了應用這些技術進行靜脈血栓形成時間推斷的專著[6，30]。FINESCHI等利用實踐中收集到的140例PTE死亡案例，對血栓組織切片進行HE、Masson、PTAH、Van Gieson、Von Kossa和Perls染色，以及纖維蛋白原、CD61（血小板）、CD45（白細胞）、CD15（中性粒細胞）、CD68（單核細胞）的免疫組織化學染色。其研究結果也表明，IRNIGER的血栓形成時間分期過于詳細，并提出了新的血栓形成時間分期標準（表2）[6]。這一分期標準在其團隊于2011年進行的43例PTE死亡案例中得到了進一步驗證[31]。

KONDO團隊在皮膚損傷愈合時間推斷的研究領域具有很深的造詣，鑒于血栓形成后機化再通過程與皮膚損傷愈合中肉芽組織形成過程的相似性，其團隊從2009年開始，在前期皮膚損傷時間推斷研究的基礎上，開展了靜脈血栓形成時間推斷的系列研究，并取得了豐厚的研究成果[30，32-38]。他們利用小鼠下腔靜脈結扎模型誘導形成深靜脈血栓，于造模后1、3、5、7、10、14和21d取材，制作血栓組織切片，通過免疫組織化學染色及多重免疫熒光技術檢測白細胞、內皮祖細胞、纖維細胞等一系列效應細胞及其分泌的活性物質的動態表達規律，其研究成果匯總如表3。

表2 FINESCHI等的血栓形成時間分期標準[6]

表3 KONDO團隊的研究成果匯總[30，32-38]

國內法醫學領域，張國忠團隊近年來率先通過建立大鼠下腔靜脈部分結扎（狹窄）模型誘導形成深靜脈血栓，對血栓組織切片進行HE染色、Perls染色、Von Kossa染色以及CD61、α-SMA和CD34免疫組織化學染色等展開了靜脈血栓形成時間推斷的相關研究[39]。其研究結果表明：術后3h可見CD61陽性血小板并于術后1 d達高峰；術后3 d含鐵血黃素開始析出，靠近血管壁的血栓組織邊緣內可見α-SMA陽性成纖維細胞及少量CD34陽性血管內皮細胞；術后1周見鈣鹽析出，CD34陽性新生血管形成。此外，王英元、孫俊紅團隊也通過建立大鼠下腔靜脈結扎模型對DVT的發生、發展機制進行了研究[40]。其研究發現，與對照組相比，術后3d的血栓組織內檢測到了差異表達的22個microRNA和487個mRNA，且經生物信息學分析發現，這些microRNA和mRNA很大一部分與內皮細胞功能相關。該研究成果一方面與IRNIGER研究發現的內皮細胞在血栓形成1周內的動態變化相印證，另一方面，也提示利用基因組學技術進行血栓形成時間推斷可獲得大量數據信息，發展前景廣闊。

4 靜脈血栓形成時間推斷研究成果綜合比較與法醫學實踐應用參考

如上所述，針對靜脈血栓形成時間推斷這一難題，國內外法醫病理學家相繼展開了系列研究。IRNIGER[23]和FINESCHI等[6]的研究成果最有應用指導價值。他們通過對法醫學實踐中收集到的大量人體血栓栓塞案例標本進行系統組織病理學評價，先后提出了各自的血栓形成時間分期標準。IRNIGER的早期研究成果是基于HE、Van Gieson、Perls等一些經典的病理學染色技術得出的，實踐操作相對簡單，但是在白細胞胞體皺縮、血栓開始發生透明變性等形態學改變的判定上沒有客觀的度量標準。其研究結果對血栓分期劃分詳細（6個階段），但是不同階段劃分在時間跨度上具有較大重疊性。FINESCHI的研究在HE、Van Kossa、Perls等染色的基礎上，進一步應用免疫組織化學染色技術對血小板、中性粒細胞、單核細胞、纖維蛋白等進行特異性標記，并觀察其形態學變化，結果更為客觀，但是其對血栓所處階段的劃分相對籠統（僅分為3個階段），在實際應用中精確性不夠。IRNIGER和FINESCHI等的分期標準都是基于血栓與血管內皮分界情況、血栓內白細胞形態、內皮細胞增殖與毛細血管新生以及血栓機化等組織病理學變化建立的，但是同一現象所對應的血栓形成時間判定結果并不一致。IRNIGER指出，血栓形成3～8 d時發生內皮細胞增生并向血栓內遷移，而FINESCHI等則認為內皮細胞增生在血栓發生第2周時才開始出現。產生這種差異的一個重要原因是被研究案例的確切血栓形成時間并不明確，研究者是結合患者的臨床資料對其血栓形成時間作出一個相對準確的推測，在這個過程中可能存在主觀判斷差異。

近年來，鼠下腔靜脈結扎模型在深靜脈血栓發生、溶解機制相關研究中應用廣泛，該模型誘導的靜脈血栓與人深靜脈血栓的動態變化規律的相似性得到了普遍認可[15]。利用動物模型進行血栓形成時間研究的一個重要優勢在于其血栓形成時間明確，所獲得的血栓早期動態變化規律準確性高、重復性好。KONDO團隊與張國忠團隊利用這一優勢分別開展了靜脈血栓形成時間推斷的基礎研究[30，32-39]。其研究發現的鼠深靜脈血栓形成3～5 d時開始出現含鐵血黃素沉積，5～7d時開始出現血管新生與鈣鹽沉積等結果，與IRNIGER利用人體標本獲得的研究結果具有很好的相似性，這表明基于動物實驗獲得的基礎研究成果具有良好的轉化應用前景。KONDO團隊與張國忠團隊在研究中利用不同白細胞的比例關系[30]、膠原纖維沉積區面積占血栓組織面積比例[33]、新生血管腔面積占原血管腔面積比例[39]等量化指標進行血栓形成時間推斷，較IRNIGER和FINESCHI等利用的“大量白細胞浸潤、膠原纖維開始沉積、毛細血管新生明顯”等形態學指標更為客觀，在將來的成果轉化中應加以推廣應用。目前，已有除了借鑒IRNIGER、FINESCHI等的分期標準外，還參考KONDO團隊提出的利用中性粒細胞與單核細胞比例關系進行靜脈血栓形成時間推斷的案例報道[41-42]。利用動物模型進行靜脈血栓形成時間推斷研究具有結果穩定、可重復性好的優點，但需要注意的是，動物模型中形成的血栓體積較小，其血栓機化及完全再通的速度更快，通常1個月即可完成，因此對于一些可以反映血栓形成時間1周以上的指標，必須經過人體樣本驗證方可證實其實際應用價值。此外，還需注意的是，張國忠團隊研究發現CD34陽性血管內皮細胞與α-SMA陽性成纖維細胞最早于血栓形成3d時開始出現[39]，而KONDO團隊研究發現其分別于血栓形成5 d及7 d時才開始出現[34]。產生這一差異的部分原因可能與KONDO團隊使用小鼠進行研究，而張國忠團隊使用的是大鼠有關。還有一個不可忽視的因素是，KONDO團隊采用的是下腔靜脈完全結扎模型，模擬的是血管內皮受損合并血流瘀滯時血栓的發生過程，而張國忠團隊采用的是下腔靜脈部分結扎（狹窄）模型，模擬的是血流緩慢時的血栓的發生過程[43]。若進一步實驗能夠證實血栓發生始動因素的差異會影響其隨后的發展變化進程，那么在將來利用人體標本進行的后續研究中，需考慮將創傷因素（如骨折、擠壓傷等）與非創傷因素（如長期臥床、肢體固定等）引發的血栓進行分組探討的必要性。

基于IRNIGER、FINESCHI、KONDO團隊的研究結果，參考SAUKKO和KNIGHT[28]的建議，結合本課題組在實踐工作中遇到的多例相關案件的鑒定經驗，筆者在此嘗試提出一個綜合的靜脈血栓形成時間分期標準（表4），以期為相關案例的鑒定提供參考。

表4 靜脈血栓形成時間分期標準

5 小結與展望

PTE是法醫學實踐中常見的猝死原因之一。對于PTE致死案件的法醫學鑒定，不僅需要通過詳細的尸體解剖檢驗及實驗室輔助檢查明確死亡原因，還需要對導致PTE的靜脈血栓形成時間進行判斷，以評判創傷或醫療干預與靜脈血栓發生的先后順序。若創傷或醫療干預的發生時間晚于靜脈血栓的形成時間，則其不應為機體死亡負主要責任。若創傷或醫療干預的發生時間早于靜脈血栓的形成時間，還需考慮血栓形成的個體易感因素，綜合評價導致靜脈血栓形成的創傷因素、個體因素以及醫源性因素的比重，以進行事故責任的劃分。此種情況下，于會永等[44]參考國內外文獻繪制的深靜脈血栓形成評價量表具有重要參考意義。在法醫學實踐中需要注意，血栓與靜脈管壁間的黏附程度以及血管內皮細胞的增殖、遷移狀態是反映血栓形成時間的重要指標，因此不可以單純通過檢查肺動脈內栓塞的栓子而對血栓形成時間作出評判。在解剖中應詳細探尋血栓的來源，尤其是在DVT好發的骨盆和下肢深靜脈，并提取檢材。靜脈血栓的形成是一個循序漸進的過程，其內部不同片層的血栓形成時間不盡相同，因此在找到導致PTE的血栓源頭后，還需對殘留的血栓進行頭、體、尾分段取材，連同血管壁及血管外組織一并取下，通過實驗室檢查對靜脈血栓的形成時間作出綜合性評判。

在法醫學領域，靜脈血栓形成時間推斷是損傷時間推斷這一重要科學問題的分支，研究的核心內容也是通過一系列生物學標志物的時序性變化規律推測血管損傷、血栓形成的時間區間。早在20世紀20年代就有學者開始關注這一問題，但是多年來該領域的研究進展相對緩慢。目前已有的研究成果中，對血栓形成時間的階段劃分跨度偏大，需要進一步細化才能更好地應用于法醫學實踐。近年來，深靜脈血栓動物模型的建立和廣泛應用極大地增進了人們對血栓形成及溶解機制的認知，以氧化應激、炎癥反應、細胞焦亡等為代表的生物學事件在靜脈血栓發生發展過程中的重要性日益凸顯。以此為契機，深入探討相關調控因子的動態表達規律，有望為靜脈血栓形成時間的法醫學推斷提供新的參考指標。在技術層面，光譜分析、質譜成像以及基因組學、蛋白組學、代謝組學等技術的快速發展為法醫學損傷時間推斷帶來了新的機遇。通過多技術聯合應用，將得到的大數據進行人工智能分析以獲取更加精確的損傷時間推斷結果是本領域的前沿發展方向。這一趨勢同樣適用于深靜脈血栓形成時間的研究，通過多組學技術聯合使用，系統檢測血栓組織內mRNA、microRNA、蛋白質、小分子代謝物的動態變化圖譜，結合血栓組織的光譜吸收峰數據和分子空間分布特征信息，進行人工神經網絡、隨機森林、偏最小二乘回歸分析等人工智能算法分析，有望得到更加精確的血栓形成時間推斷結果。以上述研究思路為導向，深入開展靜脈血栓形成時間的研究，相信未來本領域的研究成果必將會有一個質的飛躍，并將助力于“精準法醫學損傷時間推斷”這一目標的實現。