聯(lián)合多個修復(fù)相關(guān)基因的mRNA用于大鼠骨骼肌損傷時間推斷

（山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001）

損傷時間推斷一直是法醫(yī)病理學(xué)研究和鑒定的重點和難點。骨骼肌損傷后，靜止的肌衛(wèi)星細胞被激活、增殖、分化，相互融合為成肌細胞，最終形成多核的肌纖維。骨骼肌損傷修復(fù)是一個與時間變化密切相關(guān)的過程[1]，由此可以推測，骨骼肌損傷后肌衛(wèi)星細胞增殖、分化至成肌細胞和肌纖維，相關(guān)的指標應(yīng)表現(xiàn)出與時間相關(guān)的變化，可作為損傷時間推斷的指標。

DNA聚合酶δ相互作用蛋白3（polymerase deltainteracting protein 3，POLDIP3）、類染色體濃縮調(diào)節(jié)樣蛋白（regulator of chromosome condensation 1 like，RCC1L）、高脯氨酸蛋白5（proline-rich 5，PRR5）、核糖核酸輸出蛋白1（ribonucleic acid export 1，RAE1）參與肌纖維形成中能量供給、肌衛(wèi)星細胞增殖和分化過程[2-9]。本研究通過用重力錘以自由落體的方式砸傷大鼠右后肢的方法，建立早、中期不同損傷時間大鼠肌肉挫傷動物模型，觀察大鼠骨骼肌挫傷后修復(fù)過程中的組織形態(tài)學(xué)變化，采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）方法，以核糖體蛋白 L13（ribosomal protein L13，RPL13）、RPL32的mRNA作為雙內(nèi)參，使用探針法檢測損傷后肌肉組織中Rae1、Prr5、Rcc1l、Poldip3mRNA的相對表達量變化，研究其聯(lián)合應(yīng)用于推斷損傷時間的方法。

1 材料與方法

1.1 骨骼肌損傷模型制備和檢材提取

SD大鼠78只，雌雄不限，10～12周齡，體質(zhì)量250～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為對照組和損傷后 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h組，每組6只。3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（40 mg/kg）進行麻醉。用500 g重力錘通過塑料套管從高30 cm處以自由落體的方式打擊大鼠右后肢股四頭肌，制作大鼠骨骼肌損傷模型[10]，造模成功后的大鼠重新放入籠中正常飼養(yǎng)。

于損傷后4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44和48 h采用腹腔注射致死量[11]戊巴比妥鈉溶液處死大鼠，待呼吸、心搏完全停止后，在損傷中心區(qū)取1.0cm×1.0cm×0.5cm大小的骨骼肌組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，用于蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。另在損傷中心區(qū)取100 mg肌肉組織，迅速置于液氮中速凍后，放入-80℃低溫冰箱中保存。

對照組大鼠同法處死后直接在損傷組相應(yīng)部位取材。

本動物實驗方法已獲山西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究倫理審查委員會批準。

1.2 總RNA提取與RT-qPCR

采用TRIzol總RNA提取試劑盒（日本TaKaRa公司）提取大鼠肌肉組織中總RNA，利用Infinite?200 PRO NanoQuant檢測儀（瑞士Tecan公司）測定總RNA純度及濃度，當D260/D280在1.8～2.0時可用于后續(xù)實驗。使用AlleleID 6.0軟件設(shè)計內(nèi)參基因RPL13、RPL32及目的基因的引物和探針[12]，詳細信息見表1。取400 ng總RNA利用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒（日本TaKaRa公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書配制反應(yīng)混合液，利用CFX384 TouchTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）進行RT-qPCR。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，62℃ 40 s，40個循環(huán)。擴增效率在90%～110%范圍內(nèi)、相關(guān)系數(shù)在0.980以上，認為體系穩(wěn)定、擴增良好，可用于后續(xù)實驗。

表1 內(nèi)參基因RPL13、RPL32及目的基因Rae1、Rcc1l、Poldip3、Prr5的引物及探針序列

續(xù)表1

1.3 骨骼肌石蠟切片制作與HE染色

對損傷中心區(qū)骨骼肌進行適當修整，使肌束橫斷面平整，用4%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋后，使用RM2135石蠟切片機（德國Leica公司）制作成4μm厚切片，利用HE染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）進行染色，于BX61型顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 24.0軟件對通過RT-qPCR測得的4種基因的相對表達量進行單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。目前高通量mRNA芯片和第二代高通量測序均以高于對照組相對表達量的兩倍作為篩選差異表達基因的依據(jù)[12]。本研究亦采用該標準，認為表達量升高倍數(shù)＞2時與表達量升高倍數(shù)≤2時的表達性質(zhì)不同（即是否為高表達）。根據(jù)4種基因主要的高表達時間范圍區(qū)分時間段（時間段內(nèi)的時間點中高表達的指標數(shù)≥2個）。結(jié)合組織形態(tài)學(xué)觀察與時間點的表達模式對損傷組進行初步分組。采用Fisher判別分析方法[13]驗證分組的準確性，模型穩(wěn)定時計算判別的準確率[14-15]。最后通過留一法對建立的關(guān)于損傷時間推斷的Fisher判別模型進行交叉驗證[16]。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠骨骼肌損傷后的組織病理學(xué)改變

大鼠骨骼肌損傷后不同時間點的組織病理學(xué)改變見圖1。對照組大鼠骨骼肌呈多邊形，橫紋清楚，細胞核較小且位于肌細胞周圍及膜下，肌纖維排列整齊，未見壞死、水腫；損傷后4h可見損傷區(qū)肌細胞水腫、壞死明顯，細胞核消失，但未見炎癥細胞浸潤；損傷后8～12h可見損傷區(qū)有紅細胞與少量炎癥細胞存在；損傷后16～24h可見損傷區(qū)大部分肌細胞溶解、消失，炎癥細胞大量浸潤并伴有纖維組織出現(xiàn)；損傷后44～48 h損傷區(qū)成纖維數(shù)量明顯增加，并伴有少量毛細血管生成。

2.2 總RNA質(zhì)量檢測與RT-qPCR結(jié)果

提取的總RNA經(jīng)Infinite?200 PRO NanoQuant檢測后，證實D260/D280值均在1.8～2.0，RNA純度較理想，可用于后續(xù)實驗。

將cDNA進行梯度稀釋后測量各目的基因（Rae1、Prr5、Rcc1l、Poldip3）及內(nèi)參基因（RPL13、RPL32）的擴增效率：Rae1的擴增效率為103.7%，相關(guān)系數(shù)為0.993；Prr5的擴增效率為97.1%，相關(guān)系數(shù)為0.993；Rcc1l的擴增效率為100.2%，相關(guān)系數(shù)為0.996；Poldip3的擴增效率為103.7%，相關(guān)系數(shù)為0.993；RPL13的擴增效率為105.5%，相關(guān)系數(shù)為0.997；RPL32的擴增效率為103.3%，相關(guān)系數(shù)為0.997。這說明體系穩(wěn)定，擴增良好，可用于后續(xù)實驗。

2.3 大鼠骨骼肌損傷后Rae1、Prr5、Rcc1l和Poldip3 mRNA的表達情況

Rae1、Prr5、Rcc1l、Poldip3mRNA在骨骼肌損傷后的表達量均有變化，詳見表2。Rae1mRNA在損傷后16、20和24 h的表達量與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其表達倍數(shù)均小于2；Prr5mRNA在損傷后16、20、24、28、32和48h的表達量與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但其表達倍數(shù)只在損傷后16、20、24和28 h大于2；Rcc1lmRNA在損傷后4、8、12、16、24、28、36、40和44 h的表達量與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但僅在損傷后 4、8、16、24、28和 36 h的表達倍數(shù)大于 2；Poldip3mRNA在損傷后4、8、16、20、24和28h的表達量與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在損傷后8、16、20、24和28h的表達倍數(shù)大于2。

從表2可知，4種基因在損傷后16～28h主要呈高表達趨勢，因此，將損傷后的12個時間點細分為4～12h、16～28h、32～48h 3個時間段。

2.4 大鼠骨骼肌損傷后Rae1、Prr5、Rcc1l和Poldip3 mRNA的Fisher判別結(jié)果

結(jié)合組織病理學(xué)染色結(jié)果和4種基因的表達模式進行初步分組后，進一步建立Fisher判別模型進行分析。Fisher判別結(jié)果顯示，每個樣本被正確分組的準確率達85.9%，原始分組時對照組與損傷組判別的準確率分別為83.3%和86.1%（表3）。對模型進行留一法交叉驗證后對照組與損傷組判別的準確率分別為83.3%和84.7%（表4）。

圖1 大鼠骨骼肌損傷后不同時間點的組織病理學(xué)改變（HE×400）

表2 大鼠骨骼肌損傷后不同時間點4種基因的相對表達量 （n=6，±s）

表2 大鼠骨骼肌損傷后不同時間點4種基因的相對表達量 （n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05

Poldip3 mRNA 1.00±0.00 1.88±0.241）2.15±0.271）0.90±0.17 2.03±0.091）2.03±0.151）2.10±0.131）2.01±0.061）1.44±0.24 0.95±0.11 1.23±0.18 1.41±0.06 1.16±0.31組別對照傷后4h傷后8h傷后12h傷后16h傷后20h傷后24h傷后28h傷后32h傷后36h傷后40h傷后44h傷后48h Rae1 mRNA 1.00±0.00 0.91±0.31 1.17±0.25 0.81±0.11 1.65±0.211）1.54±0.201）1.61±0.231）1.05±0.19 0.72±0.31 0.92±0.21 1.06±0.23 1.11±0.09 1.08±0.11 Prr5 mRNA 1.00±0.00 1.06±0.13 1.18±0.15 0.97±0.10 2.37±0.221）2.12±0.061）2.11±0.201）2.01±0.161）1.71±0.331）1.36±0.27 1.68±0.18 1.71±0.24 1.78±0.271）Rcc1l mRNA 1.00±0.00 3.08±0.051）2.37±0.221）1.86±0.131）2.18±0.151）1.57±0.09 2.11±0.131）2.04±0.191）1.42±0.21 2.15±0.171）1.85±0.111）1.95±0.201）1.41±0.10

表3 對照組與損傷組的分類結(jié)果［n（%）］

表4 對照組與損傷組留一法交叉驗證后的分類結(jié)果［n（%）］

每個樣本被正確分類的準確率達77.8%，原始分組時各時間段判別的準確率分別為83.3%、79.2%、73.3%（表5），留一法交叉驗證后3個細分的時間段判別的準確率分別為83.3%、75.0%、73.3%（表6）。選取不加權(quán)法計算各時間段質(zhì)心后得到時間段間Fisher判別的散點圖，直觀地反映這3個細分的時間段之間有明顯的區(qū)分（圖2）。

表5 損傷后4～12h、16～28h、32～48h間的分類結(jié)果［n（%）］

表6 損傷后4～12h、16～28h、32～48h間交叉驗證后的分類結(jié)果 ［n（%）］

圖2 損傷后不同時間段的Fisher判別散點圖

3 討 論

損傷時間推斷在確定死亡時間、案件定性等方面具有十分重要的意義。早、中期損傷時間的推斷也一直是研究的重點與難點[17]。骨骼肌損傷后，機體通過分泌白細胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-13、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等炎癥因子激活體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，進一步吞噬、清除壞死的肌組織[18-19]。目前關(guān)于篩選損傷時間推斷的相關(guān)指標主要來自炎癥反應(yīng)[20-25]。炎癥反應(yīng)作為一種常見的全身反應(yīng)，發(fā)生于多種基礎(chǔ)疾病[26-27]，所以使用與炎癥反應(yīng)相關(guān)的指標推斷損傷時間可能會受到基礎(chǔ)疾病的影響。

現(xiàn) 有 研 究 結(jié) 果 證 明 ，Rae1[2]、Prr5[3-4]、Rcc1l[5，7]、Poldip3[8-9]4種基因編碼的蛋白產(chǎn)物與細胞周期，細胞骨架的構(gòu)建和分化，能量供給，蛋白質(zhì)翻譯等損傷后骨骼肌修復(fù)過程具有高度相關(guān)性。本研究采用RT-qPCR方法檢測骨骼肌損傷后mRNA的相對表達量，同時結(jié)合HE染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在損傷早期炎癥細胞浸潤不明顯時，上述4種基因在表達模式上已經(jīng)發(fā)生了變化，說明其參與了骨骼肌損傷修復(fù)過程，而且較為迅速。

目前關(guān)于損傷時間推斷的研究主要是通過尋找損傷后單個相關(guān)指標在連續(xù)的時間段內(nèi)的表達趨勢，從本研究結(jié)果中單個指標在不同時間點的表達趨勢來看，因為實驗過程中各基因在提取及檢測時存在各條件無法完全復(fù)制的情況，各指標在不同時間點的表達趨勢并未體現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，所以通過單個基因在損傷后不同時間點的變化趨勢來研究與損傷相關(guān)的時間規(guī)律具有一定的局限性。

本研究結(jié)果顯示，4種基因在骨骼肌損傷后均呈高表達，且在部分時間點的表達倍數(shù)大于2，說明隨著損傷時間的延長，相關(guān)基因的表達發(fā)生明顯的變化。聯(lián)合4種基因在各時間點的表達模式，同時結(jié)合組織病理學(xué)檢驗結(jié)果，將48h內(nèi)的損傷時間初步劃分為4～12h、16～28h、32～48h 3個時間段。

Fisher判別法是依據(jù)方差分析的思想，采用投影的方法，將處于高維度的數(shù)據(jù)投影至低維，是一種能較好區(qū)分各個分組的線性判別法。留一法交叉驗證為順序剔除一個樣點，通過剩余的n-1個樣點建立判別函數(shù)，再用建立好的判別函數(shù)對剔除的樣點進行判別，重復(fù)n次后得到誤判概率。本研究為了檢驗依據(jù)表達模式得到的上述3個分組是否準確，采用留一法交叉驗證建立Fisher判別模型對分組進行驗證，結(jié)果顯示：4～12 h的準確率為83.3%，16～28 h的準確率為75.0%，32～48 h的準確率為73.3%。Fisher判別結(jié)果驗證了聯(lián)合4個指標在損傷后各時間點的表達模式所得到的分組具有較高的準確性。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，單個基因的表達量在連續(xù)的損傷時間中不具有較強的規(guī)律性，這可能與實驗過程中存在損傷誤差或試劑誤差等系統(tǒng)誤差有關(guān)，所以聯(lián)合多指標進行損傷時間推斷可以降低系統(tǒng)誤差對結(jié)果的影響，使結(jié)果更為準確。炎癥反應(yīng)作為一種全身反應(yīng)，如果自身患有與炎癥相關(guān)的基礎(chǔ)疾病時，使用以上與骨骼肌修復(fù)相關(guān)的基因推斷損傷時間還可能減少基礎(chǔ)疾病對損傷時間推斷的影響。同時聯(lián)合多指標進行損傷時間推斷，也使得到的結(jié)果具有更高的可信度，因此在后續(xù)的研究中，本課題組會加大相關(guān)基因的檢測數(shù)量，進一步完善該方法在損傷時間推斷中的應(yīng)用，使其在損傷相關(guān)案件的鑒定中發(fā)揮實踐作用。