AChE在小鼠皮膚切創愈合過程中的時序性表達及分布

趙建新 ，金馨 ，黃俊杰 ，姚藝 ，喻林升 ，范琰琰

（1.溫州醫科大學法醫學系，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學司法鑒定中心，浙江 溫州 325035；3.溫州醫科大學司法鑒定科學技術研究所，浙江 溫州 325035）

膽堿能系統主要由4部分構成：乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）；煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）和毒蕈堿型乙酰膽堿受體（muscarinic acetylcholine receptor，mAChR）；膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）；乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）[1]。膽堿能系統最初被認為存在于神經系統和神經肌肉接頭，ACh可以作為一種經典的神經遞質介導神經信號的傳遞。然而，近年來發現，膽堿能系統普遍存在于非神經元型細胞和皮膚組織，ACh可以通過自分泌、旁分泌或內分泌方式調節非神經元型細胞的活動，發揮廣泛的生物學效應[1]。研究結果[2-3]表明，巨噬細胞（Mφ）表達α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7nAChR），ACh作用于α7nAChR抑制了Mφ釋放促炎性細胞因子，這種抗炎效應被稱為“膽堿能抗炎通路”。在皮膚創口愈合期間，ACh及其受體密切參與炎癥反應、肌成纖維細胞分化及纖維性修復的調節[1，4-8]。

研究[9-11]發現，膽堿能系統中的AChE廣泛存在于單核巨噬細胞、淋巴細胞、樹突細胞、造血細胞、成骨細胞、內皮細胞、成纖維細胞及星形膠質細胞等非神經元型細胞。AChE可以水解ACh，使ACh失去抗炎作用。AChE抑制劑毒扁豆堿顯著提升了ACh的抗炎作用，抑制Mφ釋放促炎性細胞因子[12]。而microRNA-132也可通過抑制AChE mRNA的翻譯間接促進ACh的抗炎作用[9，12-13]。此外，AChE與成纖維細胞的遷移密切相關[10]。上述研究結果提示，AChE可能參與創口愈合的炎癥反應和纖維性修復進程。故本研究擬檢測AChE在皮膚創口愈合期間的時序性表達和分布特征，旨在探討AChE在創口愈合過程中的作用及其作為創口形成時間推斷參考指標的可行性。

1 材料與方法

1.1 小鼠切創模型制作及分組

成年雄性小鼠（C57BL/KsJ）45只，8～10周齡，體質量25～30 g，被隨機分為8個切創組和1個對照組，每組5只。切創組小鼠使用2.5%水合氯醛溶液腹腔注射（0.012 mL/g）麻醉后，在背部剃毛，乙醇消毒，使用手術刀片在小鼠背部皮膚正中切割一條長1.0 cm的全層縱向切口。待小鼠復蘇后分籠飼養，注意保持創口干燥，避免感染。切創組分別于傷后6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d過量麻醉處死小鼠，取創口及周圍2.0cm×1.5cm大小的皮膚標本。將皮膚標本均等分為兩份，一份用于制作石蠟切片進行免疫組織化學染色；另一份中一部分用于提取蛋白進行Western印跡法檢測，剩余的置于-80℃冰箱備用。對照組小鼠不進行創口切割，過量麻醉處死后，取相同部位同等大小的皮膚標本進行檢測。

本實驗經溫州醫科大學倫理委員會審核通過，符合《實驗動物 福利倫理審查指南》要求。

1.2 免疫組織化學染色

將小鼠皮膚樣本放入由磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制的4%多聚甲醛溶液中進行固定，固定后進行沖水、脫水、透明、浸蠟及包埋，用石蠟切片機制成5μm厚的連續切片［切片使用3-氨丙基-乙氧基甲硅烷（3-amino propyl-triethoxy silane，APES）進行防脫處理］。切片烘干、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯、水化，置于3%過氧化氫溶液中室溫孵育10 min滅活內源性過氧化物酶。切片經抗原修復、室溫冷卻后，使用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉2 h，滴加兔抗AChE多克隆抗體（1∶500，美國Thermo Fisher Scientific公司），保濕盒中4℃孵育12h，PBS洗滌3次，滴加辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔 IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）室溫孵育20min。PBS洗滌3次，使用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒進行顯色，蘇木素復染細胞核。另使用PBS代替一抗作為陰性對照，未見假陽性染色。毗鄰切片常規進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察創口的組織學形態。

顯微鏡下在創口及其周邊區隨機選擇10個高倍視野（×400），計數AChE陽性細胞數和總細胞數，包括多形核白細胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）、單個核細胞（mononuclear cell，MNC）及成纖維樣細胞（fibroblastic cell，FBC）。統計平均每個視野PMN、MNC和FBC總的陽性細胞數和陽性細胞率（陽性細胞率=陽性細胞數/總細胞數）。

1.3 雙重免疫熒光染色

為了鑒定AChE是否被Mφ和肌成纖維細胞（myofibroblast，MyFb）表達，對切片進行雙重免疫熒光染色。切片脫蠟、水化、抗原修復后，BSA室溫封閉2h。滴加兔抗AChE多克隆抗體（1∶200，美國Thermo Fisher Scientific公司）和雞抗F4/80多克隆抗體（1∶100，英國Abcam公司）在保濕盒中4℃孵育12h，或滴加兔抗AChE多克隆抗體（1∶200）和羊抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗體（1∶100，英國Abcam公司）在保濕盒中4℃孵育12h。PBS洗滌3次。滴加Alexa Fluor 555標記的驢抗兔IgG（1∶200，美國Thermo Fisher Scientific公司）及Alexa Fluor 488標記的驢抗雞IgG（1∶100，美國Jackson ImmunoResearch公司）室溫下孵育1 h，或Alexa Fluor 555標記的驢抗兔IgG（1∶200）及Alexa Fluor 488標記的驢抗羊IgG（1∶200，美國Thermo Fisher Scientific公司）室溫下孵育1h。PBS洗滌3次，用Hoechst 33258復染細胞核，用PBS配制的50%甘油封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

正置熒光顯微鏡下在創口及其周邊區隨機選擇10個高倍視野（×400）進行觀察、拍照和分析。統計F4/80陽性細胞（Mφ）、F4/80和AChE雙陽性細胞、α-SMA陽性細胞（MyFb）、α-SMA和AChE雙陽性細胞在每個視野的平均數量，計算AChE在Mφ和MyFb中的陽性率。

1.4 蛋白制備及Western印跡法檢測

冰上使用潔凈滅菌的小剪刀將皮膚樣本剪碎，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液（sc-24948，美國Santa Cruz Biotechnology公司），組織勻漿，4℃下以12000×g離心10min，離心3次，取上清液，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，將所有樣本配制成相同濃度。加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃蛋白變性10min。上樣總蛋白量為30μg，在分離膠濃度為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），之后將蛋白轉印到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美國Millipore公司）上。用含有聚山梨酯的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽-吐溫20（tris buffered saline with tween-20，TBST）洗滌3次，完成后，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，兔抗 AChE 多克隆抗體（1∶1 000，美國 Thermo Fisher Scientific公司）4℃孵育12h。TBST洗滌3次，用HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶10 000，英國Biorbyt公司）室溫孵育2 h。TBST洗滌3次，增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）法發光。用Scion Image圖像分析軟件測定各條帶的光密度值，以βactin作為內參，計算AChE蛋白表達的相對水平（AChE與β-actin光密度的比值）。

1.5 數據處理

數據采用±s表示，使用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。采用單因素方差分析進行組間比較，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色結果

在未損傷的對照組皮膚，AChE弱表達于表皮、毛囊、皮脂腺、血管內皮、真皮中固有細胞及皮下肌層。傷后6h，少量浸潤的PMN表達AChE；傷后12h，創口區域見較多的PMN和少量的MNC表達AChE；傷后1～3d，大量浸潤的MNC呈現AChE的陽性染色；傷后5～14d，創口區域的AChE陽性細胞以FBC為主，另可見MNC、新生血管的內皮細胞及再生的表皮表達AChE。結果見圖1。

和對照組相比，AChE在各切創組總的陽性細胞數和陽性細胞率均增加，于傷后6 h開始增多，傷后1d達到峰值（表1）。

2.2 雙重免疫熒光染色結果

在對照組皮膚，真皮內見少量細胞呈現AChE和F4/80（Mφ標記物）的陽性染色，表明真皮內固有的Mφ表達AChE。在各切創組中，大部分AChE陽性的MNC表達F4/80。傷后1 d，大量AChE陽性的Mφ聚集在創口區域（圖2），隨著損傷時間的延長，創口內表達AChE的Mφ逐漸減少。

和對照組相比，各切創組AChE陽性Mφ數及AChE在Mφ中的陽性率于傷后6h開始增多，于傷后1d達到峰值（表2）。

圖1 小鼠皮膚創口愈合過程中AChE的免疫組織化學染色結果（×400）

表1 各組小鼠AChE總陽性細胞數和陽性細胞率（n=5，±s）

表1 各組小鼠AChE總陽性細胞數和陽性細胞率（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別對照傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d傷后14d總陽性細胞數2.6±0.4 6.8±0.91）26.6±2.11）2）47.1±4.91）2）43.8±3.11）31.6±1.21）2）38.7±2.91）2）31.0±1.21）2）13.8±0.81）2）陽性細胞率/%15.7±2.5 28.6±3.11）49.0±4.31）2）64.6±7.61）2）55.2±5.71）37.1±3.21）2）42.4±6.91）37.3±3.21）29.8±2.61）2）

表2 各組小鼠AChE陽性Mφ數及Mφ陽性率（n=5，±s）

表2 各組小鼠AChE陽性Mφ數及Mφ陽性率（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別對照傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d傷后14d陽性Mφ數0.8±0.2 1.5±0.31）4.9±0.71）2）38.6±3.31）2）31.6±3.11）2）11.3±1.11）2）7.2±0.91）2）6.2±1.01）2.2±0.31）2）Mφ陽性率/%15.6±4.3 17.7±3.51）31.0±4.21）2）74.7±6.41）2）65.2±6.51）33.7±3.41）2）24.9±3.21）2）29.5±4.61）14.0±2.01）2）

圖2 傷后1d小鼠皮膚創口F4/80和AChE的免疫熒光染色結果（×400）

在對照組皮膚，α-SMA（MyFb標記物）陽性染色出現在真皮內血管壁的平滑肌，未見表達α-SMA的FBC。在各切創組中，大部分AChE陽性的FBC表達α-SMA，表明AChE表達于MyFb。AChE陽性的MyFb于傷后3d開始出現在創口區域，于傷后7d達到峰值（圖3），此后逐漸減少。結果見表3。

圖3 傷后7d小鼠皮膚創口α-SMA和AChE的免疫熒光染色結果（×400）

表3 各組小鼠AChE陽性MyFb數及MyFb陽性率（n=5，±s）

表3 各組小鼠AChE陽性MyFb數及MyFb陽性率（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

MyFb陽性率/%0 37.5±5.01）49.5±4.61）2）55.4±5.01）2）48.0±3.71）2）29.0±2.71）2）組別對照傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d傷后14d陽性MyFb數0 3.2±0.41）12.8±1.21）2）23.6±2.21）2）18.4±1.41）2）6.7±0.61）2）

2.3 Western印跡法檢測結果

在對照組和各切創組均可見AChE的表達條帶，相對分子質量為68000（圖4）。創口形成后AChE表達水平呈現一定的時序性變化（表4）。和對照組相比，AChE在各切創組的表達水平均增高，于傷后1 d達峰值，此后下降，于傷后7d達到第2個峰值。傷后6h、1d、3d、7d、10d AChE的表達水平與相鄰上組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表4 各組小鼠皮膚創口AChE蛋白的相對表達量（n=5，±s）

表4 各組小鼠皮膚創口AChE蛋白的相對表達量（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

AChE蛋白的相對表達量0.94±0.05 1.83±0.211）2.03±0.281）3.06±0.371）2）1.59±0.311）2）1.29±0.101）2.04±0.171）2）1.27±0.071）2）1.28±0.191）組別對照傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d傷后14d

3 討 論

皮膚創口愈合過程可分為炎癥期、增殖期和組織再塑期，需要不同類型細胞分泌多種細胞因子及生物活性分子，精細地相互作用，協同完成修復[14]。炎癥反應、成纖維細胞增殖和遷移、血管形成及表皮再生是創口修復過程中必不可少的事件。本研究發現，皮膚創口愈合期間，AChE廣泛表達于PMN、Mφ、MyFb、新生血管內皮及再生的表皮，提示AChE可能深度參與皮膚創口愈合的調節。

膽堿能系統包含ACh、乙酰膽堿受體、ChAT和AChE。近年來研究證實，膽堿能系統不僅存在于神經系統，也存在于非神經元型細胞和組織[1]。炎癥細胞擁有完整的膽堿能系統，可以自身合成ACh[15]。ACh作用于Mφ的α7nAChR可抑制促炎性細胞因子的釋放，而AChE可以通過水解ACh終止其作用[2-3，12]。前期研究結果[16]顯示，在骨骼肌挫傷后浸潤的Mφ表達α7nAChR，提示膽堿能系統可能參與傷后炎癥反應的調節。此外，ACh可以調控皮膚創口修復[4-7]。在皮膚創口愈合期間，α7nAChR被證實表達于創口內的Mφ和MyFb[8]。本研究與前期研究結果一致，表明皮膚創口區域的Mφ和MyFb也表達AChE，提示AChE可能參與皮膚創口愈合期間炎癥反應和纖維性修復的調節。

在法醫學領域，經常使用組織病理學方法及免疫組織化學染色技術推斷創口形成時間，較多生物學指標的免疫組織化學染色結果為損傷時間推斷提供了有價值的參考依據[14，17]。然而，一些學者認為免疫組織化學染色陽性結果的分析易受主觀因素的影響，不能完全保證其精確性[18]。因此，近年來Western印跡法被應用于損傷時間推斷[16，18-19]。本研究的免疫組織化學染色結果顯示，AChE表達于PMN、MNC及FBC，在各切創組總的陽性細胞數和陽性細胞率均高于對照組，于傷后6h開始增多，傷后1d達到峰值；傷后1～10 d創口總陽性細胞數大于30，傷后1～3 d總陽性細胞數大于40，傷后1d總陽性細胞數大于45；傷后1～3d創口的總陽性細胞率大于50%，傷后1d總陽性細胞率大于60%。AChE和F4/80雙重免疫熒光染色結果顯示，AChE陽性Mφ數及AChE在Mφ中的陽性率于傷后1 d達到峰值；傷后1～5 d陽性Mφ數大于10，傷后1～3 d陽性Mφ數大于30，傷后1 d陽性Mφ數大于35；傷后1～3 d Mφ陽性率大于60%，傷后1 d Mφ陽性率大于70%。AChE和α-SMA雙重免疫熒光染色結果顯示，AChE陽性的MyFb于傷后3d開始出現在創口區域，于傷后7 d達到峰值；傷后5～10 d陽性MyFb數大于10，傷后7～10d陽性MyFb數大于15，傷后7d陽性MyFb數大于20；傷后5～10d MyFb陽性率大于45%，傷后7 d MyFb陽性率大于55%。本研究免疫組織化學染色和雙重免疫熒光染色結果表明，AChE在皮膚創口愈合期間的表達具有一定的時間規律性，AChE在Mφ和MyFb中的表達高峰可為早期創口及修復期創口形成時間的推斷提供參考依據。此外，本研究進一步使用了Western印跡法檢測AChE蛋白表達的相對水平。AChE蛋白表達水平的變化趨勢與免疫組織化學染色及雙重免疫熒光染色的結果基本一致。和對照組相比，AChE在各切創組的蛋白表達水平均增高，于傷后1d達到峰值，此后下降，于傷后7d達到第2個峰值。本研究結果提示，AChE的Western印跡法檢測可成為免疫組織化學染色及雙重免疫熒光染色檢測的補充手段，3種檢測方法相互印證，可以使分析結果更加客觀，縮小損傷時間推斷的誤差。

本研究結果證實，皮膚創口愈合期間AChE表達上調。皮膚損傷后，AChE時序性表達于PMN、Mφ、MyFb、新生血管內皮及再生的表皮，提示其可能參與創口愈合的炎癥反應和纖維性修復的調節。此外，聯合使用免疫組織化學染色、雙重免疫熒光染色和Western印跡法檢測AChE的表達，可為創口形成時間的推斷提供參考依據。然而，本研究僅提供了動物實驗數據，且未對損傷14d后創口的AChE表達進行觀察。對于法醫學實踐應用，仍需收集不同損傷時間點的人體損傷樣本進一步研究。