小鼠腦挫傷后CB2R的表達變化與損傷時間的關系

陳京偉 ，王鵬飛 ，張孟周 ，張忠鐸 ，程浩 ，孫英富 ，溫書恒 ，郭相伸 ，趙銳 ，官大威

（1.中國醫科大學法醫學院 法醫司法鑒定中心，遼寧 沈陽 110122；2.智慧檢務創新研究院 智慧司法鑒定聯合實驗室，遼寧 沈陽 110122）

腦挫傷損傷時間推斷是法醫學研究的重點課題之一。傳統的腦損傷時間推斷主要依靠腦損傷后的形態學改變。隨著分子生物學技術的應用，一些分子生物學指標被證明在腦挫傷后的表達變化具有時間規律性，可以作為推斷損傷時間的參考指標，如神經膠質原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、P25、S100 等蛋白[1-2]。這些指標在傷后表達的時間規律不同，表達變化的時間節點不夠明確，單一指標難以實現損傷時間的準確推斷，因此需要找到更多可用于腦損傷時間推斷的指標進行綜合判斷。大麻素2型受體（cannabinoid type 2 receptor，CB2R）是內源性大麻素系統的重要成員之一，是一種7次跨膜的G蛋白偶聯受體，最初被認為只表達于外周組織，參與外周組織損傷后的炎癥反應及修復過程[3-4]。本課題組前期研究[5-7]結果表明，CB2R在皮膚和骨骼肌損傷愈合過程中的表達具有時間規律性，可以作為皮膚和骨骼肌損傷時間推斷的參考指標。同時，最新的研究結果[8-9]表明，CB2R也表達于中樞神經系統的部分神經元及膠質細胞中，正常條件下CB2R的表達水平較低，然而，其具有很高的可誘導性，在腦挫傷等病理條件下CB2R的表達會迅速發生變化，從而減弱炎癥反應，發揮神經保護的作用。上述研究結果提示，腦挫傷后CB2R的表達變化可能與損傷時間具有相關性。因此，本研究擬通過建立小鼠腦挫傷模型，利用免疫組織化學染色、免疫熒光染色及Western印跡技術，檢測小鼠腦挫傷后皮質中CB2R的表達變化，探討其作為腦挫傷損傷時間推斷生物學指標的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗CB2R多克隆抗體（bs-2377R，北京博奧森生物技術有限公司），小鼠抗β-actin單克隆抗體（TA-09，北京中杉金橋生物技術有限公司），小鼠抗GFAP多克隆抗體（16825-1-AP，武漢三鷹生物技術有限公司），小鼠抗CD68單克隆抗體（ab31630，美國Abcam公司），小鼠抗NeuN單克隆抗體（MAB377，德國Merck公司），Alexa Fluor? 594驢抗小鼠IgG、Alexa Fluor? 488驢抗兔IgG（美國Thermo Fisher Scientific公司），Hoechst 33258染色液（C1017）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0009，上海碧云天生物技術有限公司），鏈霉卵白素-生物素免疫組織化學檢測試劑盒（SP-9001，北京中杉金橋生物技術有限公司），驢正常非免疫血清（北京索萊寶科技有限公司），增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（美國Millipore公司）。

1.2 實驗分組及腦挫傷模型的建立

健康成年（8周齡）清潔級雄性C57BL/6小鼠72只，體質量23～28g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。將小鼠隨機分為假手術組和傷后0.5h、1h、3h、6h、12h、1d、3d、7d、14d、21d、28d組，每組6只。

采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）進行麻醉。頭部脫毛、消毒，將小鼠頭部固定于立體定位儀上，于頭皮正中切開皮膚，切口長2cm，剝離左側顱頂骨骨膜，在左側頂骨中線旁1mm處鉆一直徑4mm的骨窗，暴露硬腦膜并保證其完整性。通過PCI3000精密顱腦損傷撞擊器（美國Hatteras Instruments公司）撞擊開窗處硬腦膜，撞擊硬腦膜的圓柱體截面直徑為3 mm，撞擊速度為1.5 m/s，深度為1 mm，持續時間為40ms，記錄撞擊完成時間，消毒，用3M組織膠水粘合頭皮切口。假手術組只做顱骨開窗，不進行撞擊。

在預先設定時間點注射過量的2%戊巴比妥鈉溶液將小鼠處死后，打開胸腔，充分暴露心臟，于左心室緩慢推注磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）50mL，取全腦，沿挫傷區正中冠狀切開大腦，一半腦組織提取挫傷區周圍2 mm腦皮質用于Western印跡法檢測，另一半置于4%多聚甲醛溶液中整體固定后用于組織形態學觀察。

本實驗操作遵循《實驗動物飼養管理和使用指南》。

1.3 免疫組織化學染色

各挫傷組腦組織固定24h后，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成組織蠟塊，進行連續切片，切片厚度為5μm，切片于37℃烤箱中烤干后室溫保存。進行免疫組織化學染色時，先將組織切片進行脫蠟水化及檸檬酸微波熱修復，其余步驟按照免疫組織化學檢測試劑盒說明書進行，CB2R抗體（1∶1000）4℃孵育過夜，以抗體稀釋液作為空白對照。

1.4 Western印跡法檢測

將收集的大腦皮質樣品置于300μL組織裂解液中，超聲細胞破碎儀冰上勻漿破碎。4℃下，以16000×g離心20min，抽取上清液，BCA法測定蛋白濃度，用細胞裂解液將上樣蛋白濃度調成一致，-80℃冰箱保存。樣品與6×上樣緩沖液以5∶1的體積比進行混合，混勻后金屬浴變性（100℃，5 min）。20 μg蛋白上樣電泳（分別為5%濃縮膠和10%分離膠）2h后用蛋白濕轉法將蛋白轉印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，8%脫脂奶粉室溫搖床封閉2h，分別加入兔抗CB2R多克隆抗體（1∶2 000）和小鼠抗β-actin單克隆抗體（1∶3000），4℃搖床孵育過夜，次日室溫復溫30min，用含有聚山梨酯的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽-吐溫20（tris buffered saline with tween-20，TBST）洗膜后用二抗稀釋液稀釋的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（1∶3000）室溫搖床孵育1h，TBST洗膜，ECL發光并采集圖像。

1.5 免疫熒光染色

CB2R分別與神經元（NeuN）、單核細胞（CD68）、星形膠質細胞（GFAP）進行免疫熒光雙重染色，觀察腦挫傷后CB2R在不同細胞的表達變化。組織切片脫蠟水化及檸檬酸微波熱修復后，10%驢血清室溫封閉2h，CB2R抗體（1∶400）分別與NenN抗體（1∶300）、GFAP抗體（1∶300）、CD68抗體（1∶200）混合后滴加，4℃孵育過夜后，切片滴加Alexa Fluor?594驢抗小鼠IgG（1∶300）和Alexa Fluor? 488驢抗兔IgG（1∶300）混合液，于保濕暗盒內室溫孵育2h。用Hoechst 33258染色液進行細胞核染色。切片經防熒光淬滅封片劑封片，并通過熒光顯微鏡觀察。以抗體稀釋液代替一抗作為空白對照。

1.6 圖像分析與數據處理

在每張免疫組織化學染色切片及免疫熒光染色切片中于挫傷區周圍皮質隨機拍攝5個視野（×400），使用Image J軟件計數免疫組織化學染色切片陽性細胞（呈棕黃色）數及總細胞數，計數免疫熒光染色切片雙陽性細胞數及總細胞數。用Gel Pro凝膠分析軟件對Western印跡法檢測圖像進行灰度值分析，以CB2R與β-actin的灰度值比值作為CB2R的相對表達水平。每組實驗在相同條件下至少重復3次。

采用GraphPad Prism 6軟件進行統計學分析，所有數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色結果

腦挫傷后CB2R陽性細胞率迅速升高，并于傷后12h第1次達到高峰，而后逐漸下降，傷后3d降至最低，之后再次升高并于傷后7d第2次達到高峰，而后再次下降并逐漸恢復至正常水平。傷后0.5h～14d各組小鼠CB2R陽性細胞率與假手術組相比均升高（P＜0.05），其余各組與假手術組相比差異無統計學意義（P＞0.05），傷后7d組CB2R陽性細胞率與傷后12h組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1、圖1。

表1 小鼠腦挫傷后不同時間點CB2R陽性細胞率（n=6，±s，%）

表1 小鼠腦挫傷后不同時間點CB2R陽性細胞率（n=6，±s，%）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

CB2R陽性細胞率14.75±0.88 24.18±2.861）24.70±1.241）29.14±1.191）35.14±0.921）41.88±2.771）29.09±0.891）2）27.74±0.811）47.13±2.201）2）29.21±1.541）2）13.75±2.162）12.42±1.44組別假手術傷后0.5h傷后1h傷后3h傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后7d傷后14d傷后21d傷后28d

圖1 小鼠腦挫傷后腦組織CB2R的免疫組織化學染色結果（×400）

2.2 Western印跡法檢測結果

CB2R在正常腦皮質中表達量較低。腦挫傷后CB2R的相對表達量逐漸升高，并于傷后12 h第1次達到高峰，隨后表達量開始下降，于傷后3d其表達量降至最低，隨后又開始升高，并于傷后7d再次達到峰值，然后持續下降，于傷后28 d基本恢復至正常水平。與假手術組相比，傷后6 h、12 h、7 d、14 d CB2R的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）；除傷后7 d和3 d比較差異有統計學意義（P＜0.05）外，其余各組與相鄰上組比較，差異均無統計學意義。詳見表2、圖2。

表2 小鼠腦挫傷后不同時間點CB2R的相對表達量（n=6，±s）

表2 小鼠腦挫傷后不同時間點CB2R的相對表達量（n=6，±s）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

CB2R相對表達量0.86±0.10 1.04±0.06 1.06±0.12 1.17±0.11 1.32±0.041）1.45±0.161）1.19±0.12 1.15±0.12 1.52±0.131）2）1.27±0.071）1.03±0.20 0.88±0.15組別假手術傷后0.5h傷后1h傷后3h傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后7d傷后14d傷后21d傷后28d

圖2 小鼠腦挫傷后CB2R在腦皮質中的表達變化

2.3 免疫熒光染色結果

腦挫傷后CB2R陽性神經元、CB2R陽性單核細胞、CB2R陽性星形膠質細胞數與總細胞數的比值變化呈單峰模式。詳見表3、圖3～5。

表3 小鼠腦挫傷后不同時間點腦皮質不同細胞標記物與CB2R共染的陽性細胞率（n=6，±s，%）

表3 小鼠腦挫傷后不同時間點腦皮質不同細胞標記物與CB2R共染的陽性細胞率（n=6，±s，%）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

CB2R陽性星形膠質細胞0.54±0.06 3.13±0.43 3.82±0.501）5.05±0.881）7.14±0.661）5.26±0.631）5.60±0.841）14.19±0.811）2）21.06±1.251）2）14.02±1.201）2）4.00±0.252）2.16±0.48組別假手術傷后0.5h傷后1h傷后3h傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后7d傷后14d傷后21d傷后28d CB2R陽性神經元9.65±0.77 23.88±2.041）25.38±1.381）25.53±2.231）28.74±2.041）38.24±2.301）2）24.16±2.721）2）14.81±1.83 7.07±0.86 9.25±1.11 11.96±0.80 10.77±1.13 CB2R陽性單核細胞0.36±0.12 1.58±0.29 1.95±0.17 3.68±0.391）6.89±1.241）2）9.95±1.201）2）17.92±1.891）2）11.48±0.631）2）2.15±0.292）1.44±0.27 1.23±0.19 0.68±0.20

圖3 傷后12h小鼠腦組織CB2R與NeuN的免疫熒光雙重染色結果（×400）

圖4 傷后1d小鼠腦組織CB2R與CD68的免疫熒光雙重染色結果（×400）

圖5 傷后7d小鼠腦組織CB2R與GFAP的免疫熒光雙重染色結果（×400）

CB2R陽性神經元數與總細胞數的比值于傷后12h達到高峰，且與其他各組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），傷后0.5 h～1 d各組CB2R陽性神經元數與總細胞數的比值均高于假手術組（P＜0.05），其余各組與假手術組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

CB2R陽性單核細胞數與總細胞數的比值于傷后1 d達到高峰，且與其他各組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），傷后3h～3d各組CB2R陽性單核細胞數與總細胞數的比值均高于假手術組（P＜0.05），其余各組與假手術組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

CB2R陽性星形膠質細胞數與總細胞數的比值于傷后7d達到高峰，且與其他各組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），傷后1 h～14 d各組CB2R陽性星形膠質細胞數與總細胞數的比值均高于假手術組（P＜0.05），其余各組與假手術組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

腦挫傷是一類常見的顱腦損傷，其損傷機制包括外力作用直接造成組織出血、壞死等原發性損傷以及由此引起的顱內壓增高、腦灌注量降低、炎癥、氧化應激等因素造成的繼發性損傷[10-11]。大量生物分子及多種細胞參與腦挫傷后的組織損傷愈合過程，這些分子及細胞在腦挫傷后的動態變化為法醫學損傷時間推斷提供了研究基礎。隨著CB2R在中樞神經系統的表達被證實，其在神經系統中的功能日益受到關注。研究結果[12-13]表明，CB2R與急性腦損傷及慢性神經退行性疾病密切相關。本研究通過免疫組織化學染色及Western印跡技術對小鼠腦挫傷后不同時間點CB2R的表達情況進行檢測。免疫組織化學染色結果表明，腦挫傷后CB2R的表達具有時間規律性，腦挫傷后CB2R的陽性細胞率變化呈雙峰模式，分別于傷后12 h及傷后7 d兩次達到高峰。Western印跡法檢測結果表明，CB2R的表達變化趨勢與免疫組織化學染色結果一致。免疫熒光染色進一步探究了腦挫傷后CB2R在不同細胞內的表達情況，結果表明，腦挫傷后CB2R在神經元、單核細胞及星形膠質細胞中均有表達，且表達具有時間規律性。

WU等[14]發現藥物誘發大鼠癲癇發作后，大鼠海馬神經元CB2R表達量顯著升高。TANG等[15]研究證明，CB2R激活后可以通過促進受損神經傳導通路恢復、誘導神經營養型小膠質細胞的增殖、激活神經營養信號通路等途徑發揮神經保護作用。以上研究結果表明，病理條件下CB2R可以發揮神經保護作用。本研究結果顯示，在正常腦組織神經元中CB2R弱表達，腦挫傷后神經元中CB2R表達逐漸升高，CB2R陽性神經元數與總細胞數的比值于傷后12h達到高峰，可能解釋了CB2R在損傷后第一個表達高峰出現的原因。

腦損傷后中樞神經系統固有炎癥細胞（如小膠質細胞）活化，同時募集循環系統中炎癥細胞（如多核粒細胞、巨噬細胞等），炎癥細胞活化后分泌炎癥因子并清除壞死組織[16]。BRAUN等[8]研究發現，腦挫傷后損傷周邊區單核細胞CB2R表達上調，激活CB2R促進了巨噬細胞由促炎的M1型向促修復的M2型的極化，從而減輕了炎癥反應并改善腦挫傷的預后。炎癥反應是神經退行性疾病發病的重要機制之一，帕金森病及阿爾茨海默病等疾病中均證實存在小膠質細胞的活化[17-18]。WU等[19]研究發現，激動CB2R后促進了淀粉樣蛋白的清除，抑制小膠質細胞的活化，減輕了神經損傷。本研究結果表明，腦挫傷后單核細胞中CB2R的表達量上調，CB2R陽性單核細胞數與總細胞數的比值于傷后1d達到高峰，提示CB2R可能對單核細胞的生物學功能具有直接的調控作用，進而參與腦挫傷后的損傷愈合過程。

星形膠質細胞是中樞神經系統主要的膠質細胞之一，具有營養、支持、調節炎癥反應及瘢痕修復的重要作用。研究發現，在癲癇模型中激活CB2R通過調節PI3K/Akt信號通路促進了星形膠質細胞的活化、增殖，減輕了神經元損傷，從而發揮了神經保護作用[20]。有研究發現，在腦挫傷模型中給予雌二醇可通過激活內源性大麻素受體抑制星形膠質細胞的活化[21]。星形膠質細胞也參與慢性神經退行性疾病相關的炎癥反應，TUMATI等[22]研究發現，激活CB2R后抑制了慢性疼痛引起的脊髓星形膠質細胞過度增殖。以上研究結果表明，病理條件下CB2R的激活可能對星形膠質細胞具有雙向調節作用。本研究發現，傷后7d CB2R陽性星形膠質細胞數與總細胞數的比值達到峰值，提示腦挫傷后CB2R可能通過對星形膠質細胞生物學功能的調節，調控腦挫傷后組織修復過程，同時也解釋了CB2R第2次表達高峰形成的可能原因。

綜上所述，腦挫傷后CB2R在神經元、單核細胞及星形膠質細胞中的動態表達提示，其可能通過調節這些細胞的生物學功能參與腦挫傷后組織的炎癥反應及修復過程。腦挫傷后CB2R的總體表達及在不同細胞中的表達均具有時間規律性，有望成為法醫學實踐中腦挫傷損傷時間推斷的輔助生物學指標。然而，本研究也具有一定的局限性，未進行相關的人體標本驗證，實際案例中腦挫傷后CB2R的表達是否具有時序性有待進一步考證。