注射用單硝酸異山梨酯細菌內毒素檢查法研究

曹霞飛 何華紅

（1 廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511405；2 廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160）

注射用單硝酸異山梨酯（Isosorbide Mononitrate for Injection）是新一代長效硝酸酯類抗心絞痛藥物，為硝酸異山梨酯的主要活性代謝產物。本品主要釋放一氧化氮使環鳥苷酸（CGM）增加而致血管擴張，降低肺動脈高壓，減少回心血量，減輕心臟負荷，從而減少心肌耗氧量；同時還可通過提高血小板內環磷酸腺苷水平抑制肺血管微血栓形成，降低肺循環阻力[1]，減輕心臟負荷，改善缺血區血流供應。近年來，該藥物已廣泛應用于心絞痛及充血性心力衰竭等心血管疾病的治療。本品尚未收載于中國藥典，國家食品藥品監督管理局國家藥品標準（試行）YBH05182003對其藥物的質量控制采用家兔法進行熱原檢查；而國家食品藥品監督管理局國家藥品標準WS1-（X-022）-2005Z中規定注射用單硝酸異山梨酯內毒素限值為不大于3.2 EU/μg。本實驗針對現有資料中，該藥物存在方法、標準不統一且限度偏低等問題進行修訂，以考察其進行細菌內毒素檢查的可行性，并提出將其限度提高至更安全合理的范圍，力求降低其在臨床使用中的熱原反應率。研究如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：恒溫水浴（SW22型），德國Julabo公司；旋渦混合器（MSI型），廣州IKA公司。所用玻璃用具和耐熱材料置于熱空氣烤箱中經250 ℃干熱2 h除去熱原。

1.2 試藥：注射用單硝酸異山梨酯（瑞陽制藥有限公司，規格：每瓶50 mg，批號：12043006；山東新時代藥業有限公司，規格：每瓶20 mg，批號：033120201；浙江普洛康裕制藥有限公司，規格：每瓶20 mg，批號：20100705B；海南新中正制藥有限公司，規格：每瓶50 mg，批號：120201；武漢華龍生物制藥有限公司，規格：每瓶25 mg，批號：20120503。

1.3 細菌內毒素工作標準品規格：批號：150601-201174，160 EU/支，中國食品藥品檢定研究院提供。

1.4 細菌內毒素檢查用水（BET水）規格：批號：1105060，50 mL/支，湛江安度斯生物有限公司產品。

1.5 鱟試劑（TAL）A：湛江安度斯生物有限公司產品，批號：1202151，靈敏度（λ）：0.25EU/mL，規格：0.1mL/支；鱟試劑（TAL）B：廈門市鱟試劑實驗廠有限公司產品，批號：110603，靈敏度（λ）：0.25 EU/mL，規格：0.1 mL/支。

2 方法與結果

2.1 內毒素限值（L）的確定[2]：注射用單硝酸異山梨酯臨床最大有效劑量為7毫克/次，依據劑量來確定，非經腸道藥品的內毒素限值L等于K/M，K是人每千克體質量的內毒素閾值，注射劑K=5 EU/（kg·h）；M是人每千克體質量在1 h內的最大注射劑量，按成人體質量60 kg計算，根據“化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則”的要求安全系數定為3，經計算得到注射用單硝酸異山梨酯的細菌內毒素限值為14 EU/mg。以此為依據，做以下可行性研究。

2.2 靈敏度復核試驗：按照中國藥典2015年版四部通則細菌內毒素檢查法，復核實驗所用鱟試劑的靈敏度測試值（λc）是否在其標示靈敏度（λ）的可接受范圍內，根據不同廠家不同規格鱟試劑靈敏度的標示值，將細菌內毒素工作標準品用BET水溶解，在旋渦混合器上混勻30 min，分別制成2倍稀釋系列，即2λ、λ、1/2λ和1/4λ四個濃度的內毒素標準溶液，試驗包括陰性對照。將溶液直接加入和等量容積（0.l mL）裝有凍干粉試劑的單次試管中，恒溫孵育一段時間[（37±1）℃，（60±2）min]，避免振動，將每支試管按順序從恒溫器中直接取出并輕輕翻轉180°觀察結果，如果內容物形成堅實凝膠并在試管翻轉后保留在原處，則記為陽性；如果未形成完整的凝膠，則結果為陰性，最低濃度的內毒素標準溶液的所有平行管都為陰性結果試驗才為有效試驗。

結果見表1，由表1可見，兩批鱟試劑經用細菌內毒素工作標準品檢查，λc/λ均在0.5～2.0，結果均符合規定。

2.3 干擾初篩試驗[3]

2.3.1 最大有效稀釋倍數是樣品的最大允許稀釋倍數，在MVD下，內毒素限值可以被判斷，此方法適應于注射液或非經腸道的以溶解或稀釋形式給藥的藥品溶液，MVD的計算公式如下：MVD=cL/λ，L=14 EU/mg，因此可計算出注射用單硝酸異山梨酯進行細菌內毒素檢測時，使用目前常用于藥品檢驗的0.25～0.03 EU/mL的鱟試劑所對應的最大有效稀釋倍數分別為56、112、224、448、896倍，對應的最低有效濃度為0.036 mg/mL、0.018 mg/mL、0.009 mg/mL、0.0045 mg/mL、0.002 mg/mL。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

2.3.2 初篩試驗：取5批注射用單硝酸異山梨酯，用細菌內毒素檢查用水（BET水）進行稀釋，使其質量濃度分別為0.036 mg/mL、0.018 mg/mL、0.009 mg/mL、0.0045 mg/mL、0.002 mg/mL將以上系列濃度溶液標記為供試品組（NPC），用上述梯度的BET水稀釋液作為溶劑，與4λ濃度內毒素標準品等比混合的方法制備含有2λ濃度內毒素的供試品，標記此系列溶液為供試品陽性對照組（PPC），取靈敏度為0.25 EU/mL的兩個不同廠家的鱟試劑進行試驗，每一稀釋濃度制備兩管，同時按常規分別設細菌內毒素陽性對照組（PC）和BET水陰性對照組（NC）各兩管，結果見表2。

表2 樣品干擾初篩試驗結果

從表2結果可見，所用的5批注射用單硝酸異山梨酯濃度稀釋到0.018 mg/mL或以下時，兩個廠家的鱟試劑與細菌內毒素反應均未見增強或抑制的干擾作用。

2.4 干擾試驗：用靈敏度為0.25 EU/mL，兩個不同廠家的鱟試劑按中國藥典2015年版四部通則的細菌內毒素檢查法進行試驗，取不同廠家5批注射用單硝酸異山梨酯用BET水將樣品稀釋至0.018 mg/mL，用BET水和供試品稀釋液將對應的細菌內毒素工作標準品稀釋成2λ、λ、1/2λ和1/4λ濃度的PPC系列和供試品稀釋液NPC系列，每一稀釋濃度平行4管，同時用上述供試品稀釋液和BET水各做兩管陰性對照管，按公式計算BET水和供試品稀釋液反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et），Es=lg-1（Xs/4），Et=lg-1（Xt/4），結果見表3。

從表3可知，5批注射用單硝酸異山梨酯用兩個廠家生產的鱟試劑進行試驗，結果注射用單硝酸異山梨酯0.018 mg/mL稀釋溶液對兩個廠家生產的鱟試劑測得的靈敏度在0.5λ～2.0λ，表明此濃度樣品溶液無干擾作用。

表3 樣品（終濃度為0.018mg/mL）干擾試驗結果

2.5 樣品細菌內毒素檢查：取5批注射用單硝酸異山梨酯，稀釋方法同2.4制成供試品溶液，使用λ=0.25 EU/mL的兩個廠家的鱟試劑進行細菌內毒素檢查，并用此稀釋液將細菌內毒素工作標準品稀釋為2λ的溶液，作為供試品的陽性對照，另外以BET水建立陽性對照和陰性對照，按中國藥典2015年版二部細菌內毒素檢查法檢查，結果見表4。

表4 樣品細菌內毒素檢查結果

從表4結果可見，陰性對照組（NC）均為陰性，供試品陽性對照組（PPC）和陽性對照組（PC）均為陽性，實驗有效；供試品組（NPC）均為陰性，表明樣品中所含細菌內毒素未超過限度規定，5批注射用單硝酸異山梨酯的細菌內毒素檢查均符合規定。

3 討 論

本研究通過比較鱟試劑與內毒素在水溶液和供試品溶液中反應的差異程度，確定供試品在某一濃度下是否對細菌內毒素檢查有增強或抑制。采用了不同廠家共5批樣品與鱟試劑的相容性進行篩查試驗，確定其無干擾濃度范圍。將注射用單硝酸異山梨酯的0.036 mg/mL、0.018 mg/mL、0.009 mg/mL、0.0045 mg/mL、0.002 mg/mL稀釋液與批號為1202151，靈敏度0.25 EU/mL（由湛江安度斯生物有限公司提供）和批號為110603，靈敏度0.25 EU/mL（由廈門市鱟試劑廠有限公司提供），兩個廠家生產的鱟試劑進行試驗。內毒素干擾預試驗結果表明注射用單硝酸異山梨酯為0.018 mg/mL或以下濃度稀釋液時對以上兩個廠家的鱟試劑無干擾作用。

隨后進行正式干擾試驗，5批注射用單硝酸異山梨酯0.018 mg/mL稀釋液與以上兩批次鱟試劑（批號同干擾篩查試驗）進行干擾試驗，結果對兩個廠家生產的鱟試劑均無干擾作用，Es/Et均在0.5～2.0，表明注射用單硝酸異山梨酯0.018 mg/mL稀釋液對以上兩個廠家鱟試劑無干擾作用。

研究表明，注射用單硝酸異山梨酯可按《中國藥典2015年版四部》通則第一法（凝膠法）進行細菌內毒素檢查，確定限值為：14 EU/mg是可行的。