隱丹參酮對宮頸鱗癌Siha細胞增殖及凋亡影響機制的研究

徐豪杰，周建超，楊文輝

(鄭州大學第三附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450052)

丹參具有活血、調經、止痛、祛瘀等功效。研究[1-2]顯示，丹參中含有數百種化學成分，主要分為水溶性的酚酸類和脂溶性的丹參酮類。丹參酮類是丹參的特征性成分之一，包括丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ等多種。其中丹參酮ⅡA和丹酚酸B被選為國家藥典中丹參質量控制的指標性成分，具有明顯的心血管保護作用。研究[3]發現，丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮I等多種丹參酮類均具有抗腫瘤活性。目前關于隱丹參酮的研究較少，本實驗主要研究隱丹參酮對宮頸鱗癌Siha細胞的細胞毒性作用的影響，初步探討其抗腫瘤作用的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料宮頸鱗癌細胞株Siha，由北京協和醫學院細胞中心提供；隱丹參酮，由中國食品藥品檢定研究院提供，純度為98%。

試劑與儀器：高糖型DMEM培養基，美國Gibco公司；四氮唑噻唑藍(MTT)，上海生物工程有限公司；牛血清，美國Gibco公司；鼠抗人E6、P53、P21、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗，美國Santa Cruz公司；其他試劑均為國產分析純。CO2培養箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；LX-800型酶聯免疫檢測儀，日本Epson公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；凝膠成像分析儀，瑞典Pharmacia公司；流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 Siha細胞常規培養在含體積分數10%胎牛血清的高糖型DMEM培養基中，培養條件為37 ℃、體積分數5% CO2及相對飽和濕度。孵育2～3 d后用質量分數0.25%胰蛋白酶消化傳代,選對數生長期的Shia細胞進行試驗。

1.2.2 MTT法測定隱丹參酮對Siha細胞的抑制作用 選取對數生長期的Shia細胞，用質量分數0.25%胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加無血清DMEM培養基，以細胞濃度3×103個/孔接種于96孔板，每孔培養基總體積為200 μL；空白對照組給予相同體積的磷酸鹽緩沖液；給藥組分別加入不同濃度的隱丹參酮(0.1、1、5、10、100 μmol·L-1)，每個濃度設6個復孔。分別培養4、8、12、16、20、24 h后，加入5 g·L-1的MTT(20 μL/孔)4 h后，吸去上清加入DMSO 150 μL/孔，微型震蕩器震蕩10 min，使其完全混勻溶解結晶，在酶標儀上于492 nm處測吸光度，每個濃度設平行重復6孔，實驗重復3次。按以下公式計算抑制率，擬合后求IC50值。細胞增殖抑制率=(1-A試驗組/A對照組)×100%。

1.2.3 細胞周期及凋亡的測定 取對數期生長的Siha細胞以1.0×105個/mL的細胞濃度接種于6孔板,分別設有空白對照組、給藥組(12、24、36、48 h)；隱丹參酮給藥濃度為(1、10、25 μmol·L-1)；空白對照組給予相同體積的磷酸鹽緩沖液。培養24 h后，胰蛋白酶消化，離心(1 000 r·min-1，5 min)，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，用體積分數70%冷乙醇使細胞懸浮固定，置于4 ℃冰箱中保存30 min，-20 ℃過夜。經核糖核酸酶消化，碘化丙啶染色，4 ℃避光染30 min后流式細胞儀監測分析，重復實驗3次。2 h內流式細胞儀檢測細胞周期分布，計算細胞增殖指數[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%]。

1.2.4 Western blot法檢測細胞蛋白 隱丹參酮給藥后，收集對數生長的Siha細胞，加入細胞裂解液，冰上放置15 min, 12 000 r·min-1離心15 min，取上清，以Bradford法作蛋白定量后置-80 ℃貯存備用。灌制質量分數10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規電泳、轉膜、封閉。一抗(1500)，4 ℃孵育過夜，二抗(15 000)，室溫孵育2 h，增強化學發光法顯色。GAPDH檢測作為內對照，進行細胞間蛋白表達的比較。

2 結果

2.1 隱丹參酮對Siha細胞增殖的抑制作用不同濃度(0.1、1、5、10、100 μmol·L-1)的隱丹參酮給藥4、8、12、16、20、24 h后, 對Siha細胞的生長呈明顯抑制作用。不同濃度(0、1、1、5、10、100 μmol·L-1)的隱丹參酮對Siha細胞的細胞毒性作用有明顯劑量和時間依賴性。見圖1。

2.2 隱丹參酮對Siha細胞的細胞周期及早期凋亡的影響與空白對照組比較,各給藥組Siha細胞生長產生G0/G1期阻滯，S期所占比例隨給藥時間的延長不斷減少，且隨著給藥時間的增加抑制作用更加明顯。見圖2。

圖1 不同濃度隱丹參酮作用不同時間后對Siha細胞的抑制作用

圖2 不同濃度隱丹參酮作用不同時間后Siha細胞生長周期變化

2.3 隱丹參酮對Siha細胞的相關蛋白表達的影響隨著隱丹參酮(25 μmol·L-1)作用時間的延長，Siha細胞E6蛋白水平表達逐漸降低，P53和P21的蛋白水平表達逐漸升高。見圖3。

圖3 隱丹參酮(25 μmol·L-1)作用不同時間后Siha細胞相關蛋白表達情況

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發展中國家的發病率及其導致的死亡率均高于發達國家[4]。與其他惡性腫瘤比較，宮頸癌多發病于中年女性[5]，一旦患病給患者及其家庭帶來極大痛苦和威脅。

隱丹參酮屬于丹參的脂溶性成分，具有菲醌結構，其中菲環結構可與DNA結合，而呋喃環和醌類結構可產生自由基，引起DNA損傷，從而抑制腫瘤細胞DNA合成[6]。丹參酮通過抑制抗增殖細胞核抗原和細胞增殖相關的基因表達發揮抗腫瘤作用[7]。

細胞凋亡與腫瘤發生、發展有密切關系，部分抗腫瘤藥物作用的強弱與其誘導腫瘤細胞凋亡的活性呈正比。誘導腫瘤細胞凋亡成為抗腫瘤藥物研發的新思路，以及評價療效的新指標[8]。有研究[9]認為大多化療藥物可以引起腫瘤細胞特定靶成分的損傷或功能喪失，從而引起細胞周期阻滯及進入細胞凋亡。

目前，許多分化誘導劑能抑制腫瘤細胞生長，誘導其分化，這主要是由某些癌基因及抑癌基因的表達抑制、失活和活化所致，其作用機制可能是通過抑制細胞原癌基因、誘導抑癌基因的表達，阻滯細胞進入S期及其DNA合成，從而誘導腫瘤細胞分化[10]。本實驗通過MTT法研究發現，不同濃度的隱丹參酮對Siha細胞的細胞毒性作用有明顯劑量和時間依賴性;流式細胞儀檢查表明，隱丹參酮對Siha細胞的細胞周期有明顯的阻滯，在抑制Siha細胞增殖的同時，可以誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，降低S期細胞比例，減慢腫瘤細胞的增殖速度，抑制DNA的合成并加速誘導細胞凋亡。DNA損傷后，P53或Mdm-2磷酸化，從而上調P21表達，導致細胞周期阻滯，進而促進DNA修復或細胞凋亡[11]。感染了人乳頭瘤病毒(HPV)的宮頸癌細胞中P53的降解是通過E6蛋白介導的泛素化途徑來實現的，正常P53功能被E6蛋白所破壞[12]。P21基因是P53的效應基因。本研究發現，隱丹參酮能夠顯著抑制HPV E6蛋白水平的表達，同時Western blot法發現P53蛋白表達增加，進而誘導其下游的P21蛋白表達增加。

綜上所述，隱丹參酮能明顯抑制宮頸鱗癌Siha細胞的增殖，這與其抑制HPV E6蛋白的表達，使P53和P21的蛋白表達逐漸升高，P53功能恢復并啟動凋亡，從而誘導Siha細胞凋亡有關。但其具體作用機制還需進一步的研究證實。