旱半夏葉柄無菌接種條件的優(yōu)化*

喻 娜 （廣安職業(yè)技術學院 四川廣安 638000）

旱半夏（Pinellia ternata）又叫地文、麻芋子等，是天南星科多年生宿根草本植物， 廣泛分布在我國各地，常見于草坡、荒地、玉米地，以地下塊莖入藥，是一種重要的中藥材，其性溫、辛辣且刺激性強、有小毒，經(jīng)炮制后有燥濕化痰、降逆止嘔等功效［1－3］。 在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，旱半夏提取物在植物病原防治方面也有很好的效果［4］。

旱半夏在自然界通過珠芽與塊莖進行無性繁殖，也可通過種子進行有性繁殖，但旱半夏種子的結實率較低， 因此在自然界主要依賴無性繁殖的方式存活。雖然旱半夏在自然界易于存活，但環(huán)境中的溫度、光照、土壤、水分等條件對旱半夏的生長影響較大；生長緩慢，易感染病毒，采集困難，也導致旱半夏的廣泛人工栽種比較困難。 目前開墾荒地、農(nóng)藥化肥的濫用、環(huán)境污染等原因導致野生的旱半夏生長環(huán)境受到了破壞， 以致旱半夏品質下降，野生資源減少，因此旱半夏在我國中藥材市場出現(xiàn)了供不應求的現(xiàn)象［5］。 對旱半夏的植物組織培養(yǎng)技術進行研究， 可通過人工化學誘變提高自然突變率創(chuàng)新品種［6］，同時為提高人工栽培旱半夏的品質及產(chǎn)量提供理論基礎和技術支持。

本實驗以旱半夏的葉柄作為外植體， 建立無菌播種的優(yōu)化條件，為旱半夏的組織培養(yǎng)、快速繁殖應用、新品種培養(yǎng)研究及生理研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗所用的旱半夏葉柄采自四川廣安地區(qū)的野生旱半夏，5月份采集當年生的幼嫩葉柄，剪成2 cm 左右長度。

1.2 方法

1.2.1 70%酒精對葉柄的消毒效果實驗 70%酒精處理不同時間對葉柄的消毒效果的影響實驗，選用基本培養(yǎng)基MS 培養(yǎng)基， 將剪好的葉柄置于超凈工作臺，70%酒精處理30 s、45 s、50 s， 無菌水分別沖洗3～5 次，2% NaClO 浸泡15 min，無菌水沖洗3～5 次，接種于培養(yǎng)基，每瓶接種5～8 段，實驗重復3 次，接種后的第5 天統(tǒng)計污染率，接種后的第20 天統(tǒng)計褐化情況和玻璃化情況。

1.2.2 H2O2對葉柄的消毒效果實驗 不同濃度的H2O2處理不同時間對葉柄的消毒效果的影響實驗，選用基本培養(yǎng)基MS 培養(yǎng)基，將剪好的葉柄置于超凈工作臺，70%酒精處理45 s，無菌水沖洗3～5 次，分別用3%、6%、9%的H2O2浸泡6 min、9 min、12 min， 無菌水沖洗3～5 次， 接種于培養(yǎng)基，每瓶接種5～8 段，實驗重復3 次，接種后的第5 天統(tǒng)計污染率，接種后的第20 天統(tǒng)計褐化情況和玻璃化情況。

1.2.3 NaClO 對葉柄的消毒效果實驗 不同濃度的NaClO 處理不同時間對葉柄的消毒效果的影響實驗，選用基本培養(yǎng)基MS 培養(yǎng)基，將剪好的葉柄置于超凈工作臺，70%酒精處理45 s， 無菌水沖洗3～5 次， 分別用2%、4%、6%的NaClO 浸泡9 min、12 min、15 min，無菌水沖洗3～5 次，接種于培養(yǎng)基，每瓶接種5～8 段，實驗重復3 次，接種后的第5 天統(tǒng)計污染率，接種后的第20 天統(tǒng)計褐化情況和玻璃化情況。

1.2.4 新潔爾滅對葉柄的消毒效果實驗 不同濃度的新潔爾滅處理不同時間對葉柄的消毒效果的影響實驗，選用基本培養(yǎng)基MS 培養(yǎng)基，將剪好的葉柄置于超凈工作臺，70%酒精處理45 s，無菌水沖洗3～5 次，分別用0.5%和1%的新潔爾滅浸泡8 min、10 min、12 min， 無菌水沖洗3～5 次，接種于培養(yǎng)基，每瓶接種5～8 段，實驗重復3 次，接種后的第5 天統(tǒng)計污染率，接種后的第20 天統(tǒng)計褐化情況和玻璃化情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

污染率（%）=（污染的葉柄段數(shù)/接種葉柄段數(shù)）×100%。

褐化情況中的無、較輕、輕度、較嚴重、嚴重分別表示其褐化率=0、0＜褐化率≤25%、26%＜褐化率≤50%、51%＜褐化率≤75%、76%＜褐化率≤100%。 其中，褐化率（%）=（褐化的葉柄段數(shù)／接種葉柄段數(shù)）×100%。

玻璃化情況中的無、較輕、輕度、較嚴重、嚴重分別表示其玻璃化=0、0＜玻璃化率≤25%、26%＜玻璃化率≤50%、51%＜玻璃化率≤75%、76%＜玻璃化率≤100%。 其中，玻璃化率（%）=（玻璃化的葉柄段數(shù)/接種葉柄段數(shù)）×100%。

2 結果分析

2.1 70%酒精對葉柄的消毒效果 70%酒精處理不同時間對葉柄的消毒效果的影響（表1），70%酒精處理時間越長污染率越低，褐化現(xiàn)象越嚴重，70%酒精處理45 s 以上污染率為0，但處理50 s時褐化現(xiàn)象就很嚴重；70%酒精處理時間越短，污染率越高，玻璃化越嚴重。在70%的酒精處理45 s，再用2% NaClO 浸泡15 min 是最佳滅菌條件。

表1 70%酒精處理不同時間對旱半夏葉柄消毒的影響

2.2 H2O2對葉柄的消毒效果 旱半夏葉柄用70%酒精處理45 s 后， 用濃度為3%、6%、9%的H2O2浸泡6 min、9 min、12 min 進行消毒（表2），6% H2O2處理旱半夏葉柄的效果較好， 低濃度H2O2處理污染率較高，材料容易玻璃化，高濃度H2O2處理材料褐化嚴重。 在70%的酒精處理45 s后，6% H2O2處理6 min 時，污染率為0，玻璃化較輕，無褐化現(xiàn)象，滅菌效果較好。

表2 不同濃度的H2O2 處理不同時間對旱半夏葉柄消毒的影響

2.3 NaClO 對葉柄的消毒效果 旱半夏葉柄用70%酒精處理45 s 后， 用濃度為2%、4%、6%的NaClO 對旱半夏葉柄進行消毒（表3），2%的NaClO處理15 min，4%的NaClO 處理9 min 和12 min，材料都沒有污染、褐化和玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)，從整體上看NaClO 處理的污染率較低， 玻璃化和褐化現(xiàn)象較少， 可以看出NaClO 較適合處理旱半夏葉柄，消毒效果較好。

表3 不同濃度的NaClO 處理不同時間對旱半夏葉柄消毒的影響

2.4 新潔爾滅對葉柄的消毒效果 旱半夏葉柄用70%酒精處理45s 后， 用0.5%和1%的新潔爾滅對旱半夏葉柄進行消毒（表4）。 不同濃度的新潔爾滅處理的污染率都較高， 玻璃化和褐化現(xiàn)象較嚴重，可以看出新潔爾滅的消毒效果不太理想。

表4 不同濃度的新潔爾滅處理不同時間對旱半夏葉柄消毒的影響

3 討論

在本實驗對葉柄消毒條件的處理設計中，消毒劑的種類、 濃度和處理時間對旱半夏葉柄的污染率、褐化和玻璃化現(xiàn)象都有影響（圖1）。在70%的酒精處理45s 后，6% H2O2處理6 min 時， 無污染，玻璃化較輕，滅菌效果較好；2%的NaClO 處理15 min，4%的NaClO 處理9 min 和12 min， 材料沒有污染、褐化和玻璃化現(xiàn)象，是最佳無菌條件。從整體看，NaClO 的處理效果比H2O2和新潔爾滅的處理效果好， 建議實踐中用NaClO 消毒旱半夏葉柄。 本實驗初步探索了旱半夏葉柄的無菌播種條件，為旱半夏的進一步研究提供基礎。

圖1 消毒劑對外植體的影響