利用固定化技術探究光質對小球藻的影響*

鄭耀賢 王愛東 胡佳娜

［1 北京師范大學（珠海）附屬高級中學 廣東珠海 519080 2 珠海市唐國安紀念學校 廣東珠海 519080］

小球藻（Chlorella sp.）是一類普生性單細胞綠藻，屬于綠藻門、綠藻綱、小球藻屬。 小球藻具有生態分布廣、易于培養、生長速度快等優點，是進行生物技術研究和環境科學研究的好材料［1］。 著名的卡爾文循環就是用小球藻做實驗材料， 最終探明了二氧化碳中的碳在光合作用中轉化為有機物中碳的途徑?！疤骄坎煌h境因素對光合作用的影響”是2017 版高中生物學課程標準中，為幫助學生達成對概念2（細胞的生存需要能量和營養物質，并通過分裂實現增殖）的理解，促進學生生物學學科核心素養提升，要求開展的教學活動。

固定化細胞是指用物理或化學方法使細胞成為不易從載體上流失的形式， 制成生物反應器用以催化生化反應、細胞數量的增殖等。與游離細胞相比，固定化細胞的優點表現為：細胞固定化載體為微生物生長提供了充足有效的空間； 保證了生物反應器內較高的細胞濃度，使得反應速度加快。藻類的生物量受到很多因素的影響， 例如光照、pH 值、氮、磷、重金屬含量等的影響［2］。 光質會影響植物的光合作用， 但是光質對固定化小球藻的影響尚未見報道， 本實驗嘗試探究光質對固定化小球藻的影響。

1 實驗材料和方法

1.1 試劑與儀器 電子天平、分光光度計、手提電腦、溶解氧傳感器、3 W LED 燈泡（白光和黃紅光）、酒精燈、10 mL 一次性注射器、紗布、海藻酸鈉、氯化鈣、檸檬酸三鈉、蒸餾水等。

1.2 藻種及培養 實驗所用藻種從校內池塘采集后經微生物純化培養所得， 采用BG-11 培養基進行培養，其組成為（1 000 mL）：NaNO31.5 g、K2HPO40.04 g、MgSO4·7H2O 0.075 g、CaCl2·7H2O 0.036 g、Na2CO30.02 g、檸檬酸0.006 g、檸檬酸鐵0.006 g、微量元素溶液A5 1 mL、氨芐青霉素（終濃度）50 μg／mL、蒸餾水補充至1 000 mL 。

培養條件為（25±1）℃、光照強度為5 000 lx、連續光照。

1.3 小球藻的固定方法 目前最常用的小球藻固定方法是海藻酸鈣包埋法， 將海藻酸鈉加熱融化后用注射器緩慢滴入到配制好的氯化鈣溶液中，立刻成為凝膠顆粒狀的海藻酸鈣，固定化膠球的直徑約為3.5 mm。

1.4 測量方法 小球藻生物量采用在680 nm 下用分光光度計測量其吸光值， 通過吸光值判斷小球藻的生物量［3］。

小球藻溶解氧采用溶解氧傳感器進行測量，探頭的膜接觸樣品時，樣品要保持一定的流速，防止與膜接觸的瞬間將該部位樣品中的溶解氧耗盡， 因此， 測量的時候需要不斷搖動探頭或者溶液，待讀數不再上升時記錄數據。

2 實驗步驟

1）將處于對數生長期的小球藻液充分搖勻后取8 mL，平均分為2 份，A 份和B 份。

2）取A 份的小球藻液+ 26 mL BG-11 培養液+0.6 g 海藻酸鈉配制成30 mL 2%海藻酸鈉凝膠，用10 mL 注射器將凝膠緩慢（1 s/滴）滴入0.15 mol／L的氯化鈣溶液中，形成直徑3.5 mm 的藻球，搖動15 min 后，濾去氯化鈣溶液，加蒸餾水潤洗3 遍［4］。將藻球平分為4 份（每份200 顆），分別加入裝有50 mL BG-11 培養液的錐形瓶中， 并用封口膜封口，分別標為A1、A2、A3、A4。

3）取B 份的小球藻液搖勻，平均分為4 份，各加入分別裝有50 mL 的BG-11 培養液的錐形瓶中，并用封口膜封口，分別標為B1、B2、B3、B4。

4）將A1、A2、B1、B2 置于3 W LED 白光燈下連續光照培養， 將A3、A4、B3、B4 置于3 W LED黃紅光燈下連續光照培養。

5）連續培養72 h。 每隔12 h，用手持技術溶解氧傳感器測量A2、B2、A4、B4 中的溶解氧，并記錄。

6）分別從A1、A3 瓶中取出20 顆固定化小球藻球，各加入裝有10 mL 0.1 mol／L 的檸檬酸鈉溶液中［5］，搖蕩，直至藻球完全 融化（約 需50 min）。將融化后的藻液分別在分光光度計中測量吸光值（OD 680），并記錄；將B1、B3 搖勻，各取2 mL 藻液測定吸光值（OD 680），并記錄。

3 實驗結果與討論

3.1 固定載體對小球藻生物量的影響 本研究采用分光光度法測量吸光度間接衡量小球藻的生物量。結果發現，海藻酸鈣凝膠小球將藻細胞固定起來，藻細胞的增殖被制約，藻細胞的增殖數量明顯比懸浮態的小球藻生物量低（圖1），白光培養下，B1 明顯大于A1，B3 明顯大于A3。對小球藻的生物量的測定還可以采用顯微計數法進行測量，后續實驗可增加顯微計數的過程， 以進一步印證吸光度的結果。

圖1 不同光質對小球藻生物量的影響

3.2 光質對小球藻生物量的影響 小球藻增殖所需能量來源于其光合作用。 小球藻細胞葉綠體的色素對不同的光質的吸收存在差異， 表現為白光條件下有利于其生物量的增加， 不過其增加并不顯著， 這可能與小球藻吸收的光質較多是黃紅光有關。 如圖1，B1 和B3 在不同光質光照下，懸浮液培養的小球藻生物量并無存在顯著差異；A1和A3 在不同光質光照下， 固定化培養的小球藻生物量也不存在顯著差異。

3.3 固定載體對小球藻溶解氧產生的影響 小球藻能應用于水產養殖等主要是因為其進行光合作用產生氧氣，增加魚塘的溶解氧，同時為動物提供優質的食物。 實驗結果顯示，固定載體雖然制約了小球藻生物量的增長，但是其對水中溶解氧的供應與懸浮液培養的相比，幾乎相等甚至更多（圖2），白光條件下的固定化小球藻其產氧量最多。這可能與凝膠小球內部多孔，具有四通八達的網絡結構有關，固定化的小球藻光合作用產生的氧氣及時擴散到凝膠球外面的溶液中，提高光合作用的效率。

3.4 光質對小球藻溶解氧產生的影響 圖2 的實驗結果顯示，白光和黃紅光條件下，小球藻的產氧量并沒有明顯差異， 這進一步印證小球藻對可見光的利用可能主要是黃紅光。 這為小球藻的培養條件提供了有益的參考。

圖2 不同光質對小球藻溶解氧產生的影響

4 結論

實驗結果顯示， 不同光質對小球藻生物量有一定影響， 黃紅光可能是小球藻光合作用利用的主要光質。 固定化載體對小球藻的生物量增長存在制約， 其生物量明顯低于懸浮液培養條件下的小球藻。 固定化小球藻的光合速率明顯高于懸浮液培養的小球藻光合速率， 這為固定化小球藻用于水產養殖、污水處理等提供了有益的參考。

5 反思

《普通高中生物學課程標準（2017年版）》提出“組織以探究為特點的主動學習是落實生物學學科核心素養的關鍵”的教學建議，提出教師應該提供更多的機會讓學生親自參與和實踐，重視信息化環境下的學習，落實科學、技術和社會（STS）相互關系，培養學生的創新精神和實踐能力［6］。 本探究創造性地將進行光合作用的小球藻利用固定化技術固定起來進行實驗探究，取得良好的實驗效果。

傳統探究環境因素對光合作用強度的影響多采用定性的方式進行研究， 本實驗利用傳感器和分光光度計等數字化工具， 實現中學生物學探究實驗的定量研究。 利用手持技術（傳感器）等進行定量研究有力地激發了學生進行科學探究的積極性［7］。 同時，固定化細胞由于可以多次重復使用，簡化了游離細胞需不斷培養菌體的繁復操作，減少營養基質的浪費?；陉P注社會，指導學生利用已有科學文化知識開展力所能及的探究很有必要，學生感受到學以致用，可激發學生進一步探究學習的興趣。