博耶和科恩重組質粒轉化實驗所證明的生物學內涵

劉紅蕾 聶劉旺

（安徽師范大學生命科學學院 安徽蕪湖 241000）

2018年全國高考卷Ⅰ第38 題是一道選做題，分值為15 分，其中的第1 小題：博耶和科恩將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達。 該研究除證明了質粒可以作為載體外， 還證明了__________ （答出2 點即可）。 該題的標準答案是：體外重組質粒可進入受體細胞并表達（4 分，其他合理答案可酌情給分）。

博耶（H. Boyer）和科恩（S. Cohen）是現代基因工程的重要奠基者， 在他們之前還有一批科學家同樣為基因工程的發展奠定了基礎。 1972年，美國斯坦福大學Berg 博士領導的研究小組， 第1次成功地在體外將猿猴病毒SV40 的DNA 和λ 噬菌體的DNA 分別進行酶切， 再用連接酶將其重組，結果獲得了雜合DNA 分子［1］。 這給生命科學研究者帶來了巨大的啟發， 不同來源的原核生物DNA 片斷可在體外重組得到雜合DNA 分子。 隨后，在1973年，斯坦福大學的Cohen 等［1］也成功地進行了另一個體外重組實驗， 并實現了細菌間性狀的轉移。這表明原核生物的DNA 不僅可在體外重組，甚至重組后的DNA 分子仍然可在大腸桿菌中繁殖。自此，基因工程在1973年正式問世。但是僅在原核生物中被實驗證明可實現。一年后，科恩和博耶進行了這道題中所描述的實驗， 即將真核生物的基因轉移到原核細胞， 并實現功能的表達。這一結果，極大沖擊了人們對生物種間界限的傳統認識， 而這一結果又能夠說明什么生物學內涵？這道高考題正是以此為背景，要求學生寫出該實驗所證明的生物學內涵。 筆者歸納總結了上述實驗所證明的論點， 以期能給教師在進行這部分內容的教學時提供更多的教學啟發， 也幫助學生在學習基因工程這一新興生物技術時能更好地理解其中的操作原理。

1 重組質粒可進入受體細胞

質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA 之外，并具有自我復制能力的很小的雙鏈環狀DNA 分子［2］。 它在很多原核細胞中都存在，自然狀態下可在原核細胞內自我復制。 由于質粒上有一個至多個限制酶的酶切位點，因此，可將外源基因導入至質粒中， 再由質粒運載至原核細胞中。博耶和科恩進行的體外轉化實驗，說明非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后仍可導入大腸桿菌， 且可以像在自然狀態下一樣進行自我復制或整合至染色體DNA 上， 并隨染色體DNA 進行轉錄和翻譯，最終表達。 該實驗說明在基因工程中，質粒可作為運載體。

在進行體外轉化實驗時， 通常都是利用質粒作為載體的。 其優勢不言而喻，主要表現為：

1）質粒具有自我復制的能力。 當外源基因導入質粒后，質粒進入受體細胞可獨立自我復制，不受擬核染色體DNA 復制的影響，即具有自身的復制原點。

2）質粒不會對受體細胞造成傷害。 質粒本身就是細胞內的遺傳物質， 對于細胞而言不屬于外來物，因此，不會對受體細胞造成傷害。

3）質粒DNA 分子上有一個至多個限制酶切割位點。 質粒可被限制酶切割開，供外源DNA 片斷（基因）插入其中。

4）質粒DNA 分子上有特殊的標記基因。當重組質粒進入受體細胞，需要對重組DNA 進行鑒定和選擇， 標記基因即可幫助人們挑選出符合要求的細胞， 例如常用的四環素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因等。

2 真核生物基因可在原核細胞中表達并實現物種間的基因交流

真核生物和原核生物遺傳信息的儲存方式是不同的， 真核生物的遺傳信息儲存在細胞核中的染色體DNA 上，而原核生物則是儲存在擬核中的染色體DNA 上，且不同物種的基因在自然狀態下相對較難進行交流和融合， 但通過人工改造的方式，摒棄生物有性繁殖的基因交流方式，改為人工操作的無性繁殖即可有效提高不同物種之間基因交流的成功率。在博耶和科恩進行的實驗中，非洲爪蟾核糖體蛋白基因就是真核細胞中控制蛋白質合成的基因， 而大腸桿菌是最常見的原核受體細胞，最終基因可表達，說明已實現了爪蟾與大腸桿菌間的基因交流。

因為原核生物大多具有體積小、繁殖快、多為單細胞生物且遺傳物質較少等特點，因此，常被用于真核生物體外轉化實驗的受體細胞。 基因工程也正是利用真核細胞的遺傳物質可在原核細胞中表達這一事實，大量生產人類所需要的，但在正常細胞代謝中產量很低的多肽。 可利用原核生物生產大量的基因工程藥物， 為更多的疑難雜癥患者帶來康復的希望， 例如白血病在20 世紀40年代之前一直被認為是不治之癥， 但現代基因工程技術則給白血病患者帶來康復的希望， 最早研制出的抗CD33 抗體為鼠源性IgG2 抗體-M195，可治療急性髓性白血病，但由于人會對此產生抗鼠抗體反應而限制了其臨床應用。現在可利用基因工程使鼠源性IgG2 抗體－M195 的恒定區序列（即抗體分子的輕鏈和重鏈中靠近C 端相對穩定的氨基酸序列）被人源序列所取代，成為人源化的M195－HuM195，然后利用原核生物大量生產，使得更多患者有康復的可能［3］。 還有人們很熟悉的治療糖尿病的胰島素，于1978年9月由美國基因工程技術公司研制。通過在細菌體內植入胰島素基因，人類從此不再需要從豬、牛等動物體內獲取胰島素。 這不僅開啟了生物工程藥物的新紀元，也給全世界糖尿病患者帶來了福音，具體應用過程如圖1。

圖1 利用基因工程合成胰島素過程示意圖

3 幾乎所有生物都共用一套遺傳密碼子

在細胞中將mRNA 翻譯為蛋白質的過程中，堿基與氨基酸之間是通過密碼子配對的，mRNA上3 個相鄰的堿基決定了1 個氨基酸， 這3 個堿基就是1 個密碼子。 該實驗中非洲爪蟾的基因能在大腸桿菌中表達， 說明非洲爪蟾和大腸桿菌是共用一套密碼子的。通過大量的科學實驗證明，目前大多數生物使用的密碼子具有通用性， 但也發現極少數例外。 在支原體中，終止密碼子UGA 被用于編碼色氨酸；在四膜蟲（Tetrahymena）及草履蟲（Paramecium）等一些纖毛蟲中,UGA 是唯一的終止密碼子，UAA 和UAG 編碼谷氨酰胺；而在游仆蟲的一些基因中，通用終止密碼子UGA 不作為終止信號,而是編碼半胱氨酸［4］。 此外，在對人、牛及酵母線粒體DNA 序列和結構的研究中，也發現一些密碼子使用的特殊情況。線粒體與核DNA 密碼子使用情況相應的對比如表1 所示。

表1 線粒體與核DNA 密碼子使用情況的比較［5］

由此可見，密碼子不僅具有通用性，同時還具有一定的特殊性。 因此在選擇受體細胞時應盡量避開使用這些具有特殊密碼子的生物， 以免在進行體外轉化實驗時發生翻譯的錯亂。 除了某些生物具有特殊的密碼子外， 不同物種使用密碼子的偏好性也不同， 主要是由于不同的生物攜帶不同的反密碼子tRNA 含量是不同的， 例如在大腸桿菌中， 就發現AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA 和GTC 共8 種稀有密碼子。當導入外源基因進行表達時，如果稀有密碼子連續出現，則會抑制一些蛋白質的合成，發生翻譯的錯誤［6］。 所以，要想使導入的外源基因成功表達也是需要進行篩選和檢測的。

4 生物體內有機大分子的構成都遵循共同的規則

從分子生物學的角度出發， 生物的物質構成其實具有簡單原則：

1）所有生物的構成分子種類相似，例如DNA、RNA、蛋白質、糖等，都是以碳原子為核心，且通過共價鍵的形式與其他一些原子構成， 本質上可以說是相通的。

2）構成生物大分子的單體也幾乎都一致。 蛋白質分子都是由大約20 種氨基酸通過脫水縮合、盤曲折疊形成的，DNA 都是由4 種脫氧核糖核苷酸形成，RNA 也都是由4 種核糖核苷酸形成的。

因此，在進行基因工程操作時，外源基因導入受體細胞后，DNA 的復制和轉錄能利用受體細胞中游離的核苷酸， 翻譯過程也可利用受體細胞中游離的氨基酸。 此過程并不會因為原料的差異或構成方式的不同導致外源基因無法表達。

通過這樣一個簡單的體外轉化實驗， 人們不僅能證明重組質粒可進入受體細胞、 真核生物基因可在原核細胞中表達， 并實現物種間的基因交流，以及幾乎所有生物都共用一套遺傳密碼子，同時， 也能從分子層面證明生物體內有機大分子的構成都遵循共同的規則。

《普通高中生物學課程標準（2017年版）》明確提出現階段的高中生物學教學要以培養學生的生命觀念、 科學思維、 科學探究和社會責任為目標。 教師更應注重教材概念或科學實驗等背后所蘊含的生物學原理，讓學生知其然，知其所以然。通過一道高考題便能帶來如此多的思考， 教材中還有諸多值得深思的內容等待教師帶領學生進行探索發現。