寧夏枸杞水提物對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠的降糖作用

胡馨予， 盧文倩， 孫曉琪， 許紅凱， 張 巍， 張世強(qiáng)， 寇 玲

（1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 臨床醫(yī)學(xué)部，吉林 長(zhǎng)春130013；2.吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130012；3.江蘇大學(xué) 附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江212000）

隨著人們生活水平的提高及生活方式的改變，世界上糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。世界上大約有3%的人患有糖尿病[1]。糖尿病主要包括兩種類型，即I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病也稱胰島素依賴型糖尿病 （IDDM），占糖尿病患者的5%～10%，該種類型糖尿病是機(jī)體胰島β細(xì)胞選擇性損傷引起的自身免疫性疾病。遺傳和環(huán)境兩種因素相互作用導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失衡，β細(xì)胞喪失免疫耐受功能而遭受免疫攻擊，不能產(chǎn)生胰島素，血糖不能得到控制，最終導(dǎo)致一個(gè)持續(xù)的高血糖現(xiàn)象和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。I型糖尿病的典型癥狀是多尿、煩渴、疲勞、體重減輕、柔弱、酮酸中毒和低胰島素濃度。I型糖尿病通常發(fā)生在孩子和年輕人身上，但可以發(fā)生在任何年齡段。I型糖尿病人必須依靠注射胰島素才能存活[2-3]。目前臨床上用來(lái)治療糖尿病的藥物主要分為胰島素及其類似物、胰島素分泌促進(jìn)劑、胰島素敏感性改善因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、醛糖還原酶抑制劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑和蛋白糖基化抑制劑，大多數(shù)藥物為化學(xué)合成藥物[4-5]。而這些治療藥物或多或少存在一些缺點(diǎn)，包括嚴(yán)重的低血糖癥、乳酸中毒、特殊肝細(xì)胞損傷、永久性神經(jīng)損傷、消化不良、頭痛、頭昏眼花甚至死亡[6]。糖尿病患者人數(shù)的增加與藥物治療帶來(lái)的負(fù)效應(yīng)之間存在極大的矛盾，對(duì)于醫(yī)藥行業(yè)來(lái)說(shuō)仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，許多研究者正在積極的研究傳統(tǒng)上被用作保健品的天然藥物的降血糖作用[7]。

枸杞子之名始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，含有豐富的胡蘿卜素、多種維生素和鈣、鐵等健康眼睛的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。歷代醫(yī)家治療肝血不足、腎陰虧虛引起的視物昏化和夜盲癥，常常使用枸杞子。近代，枸杞子被證明具有延緩衰老，抗疲勞，抗脂肪肝以及提高免疫的功效。研究表明，天然植物如茶葉、當(dāng)歸、人參、軟棗獼猴桃、枸杞等具有降血糖的作用[8]，枸杞子雖然被報(bào)道具有降血糖的活性，但仍缺乏相關(guān)的系統(tǒng)研究。

作者采用四氧嘧啶建立I型糖尿病小鼠模型，考察高產(chǎn)寧夏枸杞水提取物（LBWE）對(duì)糖尿病模型小鼠血糖水平的調(diào)節(jié)作用，并深入探討其對(duì)血脂以及體內(nèi)氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑和儀器

原料:寧夏枸杞；昆明系小鼠:雄性，體重18～22 g。合格證號(hào)為SCXK-（吉）2010-0001，由長(zhǎng)春生物制品研究所提供。

三諾安穩(wěn)血糖測(cè)試儀：長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司；UVMINI-1240型分光光度計(jì)：日本島津株式會(huì)社；GENESIS SQ 25ES型冷凍干燥機(jī)：美國(guó)；SMF-320A多級(jí)閃蒸器：河南金鼎科技公司；HS-4B恒溫循環(huán)水浴鍋：成都儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將寧夏枸杞搗碎，在80℃、料液比 1∶80（g/mL）、提取時(shí)間 3 h條件下，提取 3次。 合并提取液，并采用多級(jí)閃蒸器濃縮。濃縮得到的提取物經(jīng)冷凍干燥后置-20℃冰箱中，保存?zhèn)溆茫褂们吧睇}水溶解。

1.2.2 I型糖尿病小鼠模型的建立及藥物處理 選取飲用了7 d 15%葡萄糖水的小鼠（食物正常）建立糖尿病動(dòng)物模型。于小鼠禁食（不禁水）16 h后，腹腔注射四氧嘧啶溶液（150 mg/kg，溶于生理鹽水，現(xiàn)用現(xiàn)配）。于注射后3 h灌胃給予25%葡萄糖1 mL/100 g。24 h后重復(fù)此過(guò)程一次。建模72 h后，眼靜脈叢采血，測(cè)定空腹血糖濃度，其中血糖濃度不低于11.l mmol/L的小鼠被視為造模成功小鼠。

成功構(gòu)建的糖尿病小鼠隨機(jī)分為五組，每組10只，分別進(jìn)行以下操作：

糖尿病模型組（Model）：灌胃給予10 mL/kg生理鹽水；

陽(yáng)性對(duì)照組（Met）：灌胃給予125 mg/kg的鹽酸二甲雙胍溶液（Met）；

枸杞子水提物給藥組：灌胃給予枸杞子水提成分，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.1、0.3、0.9 g/kg；

隨機(jī)選取正常小鼠10只，每天灌胃給予10 mL/kg生理鹽水，作為空白對(duì)照組（CTRL）。

每天定時(shí)給各組小鼠給藥1次，持續(xù)4周，每天記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神狀況、毛發(fā)色澤、飲水和進(jìn)食以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物排泄等一般生活狀況。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每周稱量一次體重，末次給藥后，計(jì)算給藥前后小鼠體重增加情況。為確保生活環(huán)境的干凈、清潔，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在飼養(yǎng)期間需要每天換水，每隔3天更換墊料，飼養(yǎng)室溫度和濕度分別保持在 （22±1）℃和50%～65%，且無(wú)對(duì)流風(fēng)，日照時(shí)間為12 h/d。

1.2.3 小鼠飲食、飲水測(cè)定 末次給藥后，將小鼠分別置于代謝籠內(nèi)，觀察各組小鼠12 h內(nèi)的飲食和飲水情況并記錄。

1.2.4 糖耐量實(shí)驗(yàn)方法 各組小鼠連續(xù)給藥28 d后，斷糧12 h后，眼眶后靜脈叢取血測(cè)血糖值作為初始血糖值，再灌胃給予2 g/kg葡萄糖溶液，分別于給予葡萄糖后0.5、1、2 h再次取血測(cè)定各組血糖值。觀察大鼠調(diào)節(jié)血糖的能力。血糖曲線（AUC）下的面積的計(jì)算是根據(jù)公式進(jìn)行：

AUC=（0 h 血糖+0.5 h 血糖）×0.25+（0.5 h 血糖+1 h血糖）×0.25+（1h血糖+2 h血糖）×0.5

1.2.5 血液樣本收集 糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠禁食 （不禁水）12 h后摘眼球取血，血液靜置30 min 后離心分離血清（3 500 r/min，20 min），將其分裝于1.5 mL的EP管中，置于-80℃冰箱保存待用。

1.2.6 血糖檢測(cè)方法 依照血糖測(cè)定試劑盒說(shuō)明，分別于給藥0 d和28 d時(shí)測(cè)定各組小鼠空腹血糖濃度。

1.2.7 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽超氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）濃度測(cè)定 依照試劑盒說(shuō)明，測(cè)定小鼠血清中SOD、GSH-Px活性和MDA濃度，考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定勻漿液中總蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.8 高密度脂蛋白 （HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）濃度的測(cè)定 依據(jù)試劑盒說(shuō)明，測(cè)定小鼠血清LDL-C和HDL-C的濃度。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析方法 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。運(yùn)用軟件SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。若P≤0.05則被認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，而P≤0.01被認(rèn)為存在非常顯著的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 枸杞水提取物對(duì)糖尿病大鼠體重、攝水量和攝食量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體重增加緩慢。給藥4周后，與模型組相比，Met組和高劑量枸杞水提物（0.9 g/kg）顯著改善小鼠的生長(zhǎng)狀況，體重有明顯增加（P＜0.05），見表 1。在給藥 28 d后，觀察各組攝食量和攝水量變化，與CTRL組相比，模型組小鼠消耗更多的食物和水（P＜0.05），這符合糖尿病“三多一少”的特征。與Met藥效相類似，枸杞水提物能能明顯減少小鼠的攝水量和攝食量，并趨于恢復(fù)正常水平（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞具有改善糖尿病小鼠生存狀況的作用，并能促進(jìn)糖尿病小鼠體重恢復(fù)。

表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重增加、食物攝取及水?dāng)z取統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Results on the bodyweight gain，food intake and water intake in each experimental group

2.2 枸杞水提取物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

血糖是細(xì)胞組織能量供應(yīng)的主要物質(zhì)，長(zhǎng)時(shí)間的血糖過(guò)低或過(guò)高都會(huì)誘發(fā)身體的異常。高血糖是診斷糖尿病的最直觀指標(biāo)。連續(xù)給藥28 d后，分別于0 d和28 d測(cè)定小鼠血糖變化，第0天血糖值做為模型成功與否評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)（結(jié)果未給出），末次給藥后測(cè)定空腹血糖，模型組空腹血糖水平仍高于11.1 mmol/L，與 CTRL 組差異顯著（P＜0.01），說(shuō)明四氧嘧啶能成功建立穩(wěn)定的I型糖尿病小鼠模型。與模型組相比，LBWE在 0.3 g/kg和 0.9 g/kg時(shí)降低了28.38%和44.29%的空腹血糖水平 （P＜0.01），見圖1。說(shuō)明枸杞水提取物能夠有效降低實(shí)驗(yàn)糖尿病動(dòng)物的血糖水平，具有降血糖活性。

2.3 枸杞水提取物對(duì)糖尿病小鼠口服糖耐量的影響

圖1 枸杞子水提取物對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖水平的影響Fig.1 Effect of LBWE on fasting plasma glucose level in diabetic mouse

口服糖耐量是除空腹血糖指標(biāo)外，可以輔助診斷糖尿病的指標(biāo)。作為一種葡萄糖負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，口服糖耐量用以了解胰島β細(xì)胞功能和機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力[9]。給藥28 d后，各組動(dòng)物口服2 g/kg葡萄糖溶液，2 h內(nèi)觀察血糖的變化。CTRL組小鼠在口服葡萄糖溶液后，0.5 h時(shí)血糖水平略有升高，1 h后血糖恢復(fù)至正常水平。而模型組小鼠在給予葡萄糖溶液 0.5 h 時(shí)，血糖達(dá)到峰值（31.81±1.19） mmol/L，2 h時(shí)仍處于高位。各藥物處理后的小鼠在給予葡萄糖溶液后0.5 h均出現(xiàn)峰值，但Met組以及LBWE中、高劑量組（0.3 g/kg和0.9 g/kg）在1 h后血糖開始向正常水平恢復(fù)。在2 h時(shí)，0.9 g/kg LBWE治療小鼠，其血糖水平已經(jīng)恢復(fù)到 （8.99±2.08） mmol/L，見圖 2（a）。 AUC 結(jié)果數(shù)據(jù)與血糖水平保持一致，見圖2（b）。以上結(jié)果顯示，枸杞提取物可改善四氧嘧啶誘導(dǎo)的小鼠的糖耐量情況，表明其對(duì)外源葡萄糖導(dǎo)致的血糖升高有一定的調(diào)節(jié)作用。

2.4 枸杞水提取物對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響

高血糖合并脂質(zhì)代謝紊亂常在糖尿病患者中被監(jiān)控到，具體表現(xiàn)為高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）降低，低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）水平升高[10]。與CTRL小鼠相比，四氧嘧啶誘導(dǎo)后，模型小鼠血清中HDL-C水平上調(diào)，而LDL-C濃度下降（P＜0.01），見圖 3。 同 Met給藥具有相似效果，與模型組相比，LBWE在0.9 g/kg時(shí)降低了40.71%血清中 LDL-C濃度 （P＜0.01； 圖 3 （a））， 并升高了116.91%HDL-C 水平（P＜0.01；圖 3（b））。結(jié)果表明，枸杞水提取物具有與Met相似的效果，可以改善糖尿病引起的血脂的異常現(xiàn)象，降低糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。

圖2 枸杞子水提取物對(duì)糖尿病小鼠口服糖耐量和AUC的影響Fig.2 Effect of LBWE on oral glucose tolerance and AUC in diabetic mouse

2.5 枸杞水提取物對(duì)糖尿病小鼠抗氧化活性的影響

氧化應(yīng)激是糖尿病的并發(fā)癥，也是發(fā)病的主要病理[11]。丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一。SOD可將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）可以清除由活性氧和·OH誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。與空白組小鼠相比，四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清GSH-Px以及SOD含量明顯減少（P＜0.01），而 MDA 含量則顯著升高（P＜0.01），見圖4。說(shuō)明四氧嘧啶導(dǎo)致糖尿病小鼠發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化現(xiàn)象，使得自身清除自由基的能力下降，氧化應(yīng)激水平升高，而各藥物能不同程度的緩解這種現(xiàn)象。給予4周的Met和枸杞子水提取物治療后，小鼠血清中SOD、GSH-Px活性均顯著高于模型組，而血清中MDA活性明顯低于模型組（P＜0.05）。由比較得知，枸杞子水提取物的效果要好于Met。現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)枸杞子水提取可以改善糖尿病引起的氧化應(yīng)激效應(yīng)。

圖 3 枸杞子水提取物對(duì)糖尿病小鼠血清低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）的影響Fig.3 Effect of LBWE on LDL-C and HDL-C in diabetic mouse

圖4 枸杞子水提取物對(duì)糖尿病小鼠血清GSH-Px、SOD和MDA的影響Fig.4 Effect of LBWE on GSH-Px，SOD and MDA in diabetic rats

3 結(jié) 語(yǔ)

作者采用四氧嘧啶誘導(dǎo)建立實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠模型，對(duì)寧夏枸杞子提取物的降血糖和降血脂作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：

1）枸杞子水提取物具有降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖水平、改善口服葡萄糖耐量，緩解四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體質(zhì)量減少的功效；

2）測(cè)定糖尿病小鼠血清LDL-C和HDL-C的濃度，表明枸杞子水提取物可有效改善糖尿病引起的血脂的異常現(xiàn)象，具有降血脂活性；

3）通過(guò)考察枸杞子提取物對(duì)血清中SOD、GSH-Px和MDA濃度的調(diào)節(jié)作用，初步分析其可能的降血糖機(jī)制。結(jié)果表明，枸杞子水提取物可能通過(guò)改善氧化應(yīng)激，減少胰島細(xì)胞的氧化損傷而起到降血糖作用。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道稱，植物中具有多種化學(xué)成分，其中多糖類、黃酮類、生物堿類、皂苷類、多肽類、多酚類以及不飽和脂肪酸等具有一定程度的降血糖活性。大部分的降糖藥用菌的活性成分是多糖類。多糖可以通過(guò)影響胰島素及其受體、升糖激素和糖原等起效[12-13]。在日后研究中，將進(jìn)一步對(duì)于枸杞子中純化多糖降血糖活性進(jìn)行探討。