材料表面浸潤性對(duì)細(xì)菌粘附的影響

張 薇， 陸乃彥， 陳曉霞， 周 鵬

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

生物膜是微生物為了適應(yīng)脅迫環(huán)境而形成的有利于其生存的特殊生長狀態(tài)，是由其自身分泌胞外粘質(zhì)物包裹的、具有高度組織化的多細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)。生物膜的形成常出現(xiàn)在食品制造、醫(yī)療植入等領(lǐng)域中，導(dǎo)致食品污染、病菌感染等嚴(yán)重問題。在食品加工過程中，病原體生物膜的形成，是食品傳播類疾病的主要成因。在美國，此類疾病每年引起數(shù)千人死亡，造成780多億美元的經(jīng)濟(jì)損失[1]。因此，抑制生物膜形成對(duì)于預(yù)防微生物污染具有十分重要的意義。

生物膜的形成分為5個(gè)階段，可逆接觸階段、不可逆接觸階段、菌落形成階段、生物膜成熟階段以及生物膜老化脫落階段[2]，其中，細(xì)菌粘附是生物膜形成的第一步。成熟的生物膜對(duì)紫外光等多種常規(guī)處理方式具有抵抗作用[3]，因此，抑制細(xì)菌粘附在生物膜形成的早期對(duì)其進(jìn)行控制是十分重要的。

影響細(xì)菌粘附情況的因素主要包括材料的表面電荷、表面化學(xué)組成、表面粗糙度、表面浸潤性、材料剛性等[4]，這些材料的性質(zhì)以及細(xì)菌本身的性質(zhì)決定了細(xì)菌與表面的相互作用情況。由于細(xì)菌與材料的相互作用體系較為復(fù)雜，目前尚未有完善的理論模型來解釋各因素在細(xì)菌粘附過程中的作用，因此，亟需系統(tǒng)地研究材料的各性質(zhì)對(duì)細(xì)菌粘附情況的影響趨勢(shì)，以及細(xì)菌對(duì)不同環(huán)境所產(chǎn)生的響應(yīng)情況。其中，對(duì)材料表面浸潤性這一影響因素的研究結(jié)果存在一定爭議，許多研究者認(rèn)為，疏水材料表面對(duì)細(xì)菌的抗粘附性更強(qiáng)[5-6]，但也有部分研究結(jié)果表面，親水性的表面更有利于抗細(xì)菌粘附[7-9]。這些相悖的結(jié)論可能是由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境的復(fù)雜性以及材料、細(xì)菌表面物理化學(xué)性質(zhì)的差異等因素造成的。因此，深入分析材料表面浸潤性對(duì)其抗細(xì)菌粘附能力的影響有助于人們理解兩者復(fù)雜的相互作用機(jī)理。

作者通過化學(xué)接枝的方法，制備了不同浸潤性的十八硫醇/半胱胺、十八硫醇/巰基丙酸混合單分子層表面材料，系統(tǒng)地研究了材料表面浸潤性對(duì)其抗細(xì)菌粘附能力的影響，并通過對(duì)3株食品中常見的有害菌株：大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，發(fā)現(xiàn)隨著材料表面疏水性的增加，其抗細(xì)菌粘附的能力顯著提升。另外，材料表面的電性也對(duì)其抗細(xì)菌粘附的能力有影響，表面帶負(fù)電材料的抗菌性明顯優(yōu)于表面帶正電的材料。這些研究結(jié)果有助于為食品體系中抑制細(xì)菌粘附材料的設(shè)計(jì)和制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli BL21）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）：購買于美國ATCC菌種庫；十八硫醇、半胱胺、3-巰基丙酸、FITC熒光染料：由Sigma公司提供；蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、大豆蛋白胨、葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉及無水乙醇：分析純，購于上海國藥集團(tuán)；激光共聚焦專用玻底培養(yǎng)皿D35C4-20-1-N：杭州生友生物技術(shù)有限公司。

CLSM710激光共聚焦顯微鏡：德國蔡司公司；原子力顯微鏡Bruker Dimension ICON：德國布魯克科技有限公司；K550X全自動(dòng)磁控離子濺射儀：英國Emitech公司；光學(xué)接觸角測(cè)量儀DSA100：德國Krüss GmbH公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)：日本島津企業(yè)管理有限公司；超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；GI-36全自動(dòng)立式殺菌鍋：廈門致微儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同表面疏水性材料的制備 將單拋硅片裁成1 cm×0.5 cm大小，放入濃硫酸∶雙氧水體積比為3∶1的溶液中，加熱至90℃保持2 h，以除去硅片表面的有機(jī)物，隨后用超純水沖洗，并用氮?dú)獯蹈伞⒐杵湃胝婵斟兡x，調(diào)節(jié)真空度為1×10-1mbar，在45 mA工作電流下，噴金2 min，在硅片表面得到厚度為70 nm的金薄膜。

分別配置濃度2 mmol/L十八硫醇、10 mmol/L半胱胺的乙醇溶液，首先將表面鍍金的硅片放入半胱胺溶液中接枝，接枝時(shí)間分別為 5、10、30、60 min，隨后將硅片取出，用無水乙醇沖洗，除去未接枝的半胱胺，隨后放入十八硫醇溶液中繼續(xù)接枝24 h，將接枝后的鍍金硅片在無水乙醇中漂洗兩遍后用氮?dú)獯蹈蒣10]。

同樣配置10 mmol/L的3-巰基丙酸乙醇溶液，與十八硫醇混合接枝到金表面，操作過程與半胱胺/十八硫醇混合接枝相同。

1.2.2 接枝薄膜的表面形貌表征 利用原子力顯微鏡對(duì)接枝后的樣品進(jìn)行表面形貌表征。采用接觸模式（Contact mode），探針型號(hào)為 SNL-A，掃描速率為0.977 Hz，所采集的圖像均經(jīng)過flatterning處理來彌補(bǔ)樣品傾斜所造成的偏差。

1.2.3 接枝薄膜的表面浸潤性表征 利用光學(xué)接觸角測(cè)量儀對(duì)接枝后的材料進(jìn)行表面浸潤性的表征。在室溫下測(cè)定樣品表面接觸角，液滴體積2 μL，待水滴滴在樣品表面15 s后拍照，利用儀器自帶軟件進(jìn)行接觸角計(jì)算。每個(gè)樣品表面選取3個(gè)不同位置分別進(jìn)行測(cè)定，取平均值，得到接觸角數(shù)據(jù)。

1.2.4 細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn) 大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌均保藏于-80℃甘油管中。用斜面培養(yǎng)基對(duì)三株菌進(jìn)行活化后，分別取兩針接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min下培養(yǎng)12 h，使菌體生長達(dá)到對(duì)數(shù)期。4℃下離心收集菌體，用pH 7.4、0.08 mol/L PBS緩沖液洗滌兩次，用PBS調(diào)節(jié)菌懸液，使其 OD600為（0.6±0.05）×10-8CFU/mL。接下來，大腸桿菌懸液以1%濃度接入M63培養(yǎng)基，銅綠假單胞菌懸液、金黃色葡萄球菌懸液以同樣的濃度接進(jìn)TSB培養(yǎng)基中，將接枝后的材料置于六孔培養(yǎng)板底部，接入含有菌懸液的新鮮培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)5 h。

1.2.5 激光共聚焦樣品處理及觀察 將培養(yǎng)好的材料取出，于0.08 mol/L PBS中漂洗，去除未粘附的菌體。用含2.5%戊二醛、2%多聚甲醛的PBS緩沖液液固定15 min，以保存細(xì)菌細(xì)胞和組織的原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。將樣品在PBS緩沖液中漂洗10 min，置于10 μg/mL的FITC溶液中染色30 min，再用PBS緩沖液漂洗兩次[11]。

將處理好的樣品反面向上放置于玻底培養(yǎng)皿中，在激光共聚焦熒光顯微鏡（LSM710，德國蔡司公司）下觀察。FITC在488 nm激光下激發(fā)，用40×物鏡獲取圖像。每個(gè)樣品隨機(jī)選取三個(gè)不同位置進(jìn)行觀察并拍照，使用 CLSM自帶軟件ZEN 2012（蔡司，德國）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用整張圖片的熒光覆蓋率表示已粘附細(xì)菌的量[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 接枝后樣品的表面性質(zhì)

十八硫醇、半胱胺及巰基丙酸的分子結(jié)構(gòu)式見圖1。他們的共同基團(tuán)巰基與樣品表面形成Au-S鍵，共價(jià)接枝到樣品表面。用AFM對(duì)其形貌進(jìn)行表征，見圖2。可以看到，接枝材料在樣品表面形成一層單分子層，由于分子排斥體積效應(yīng)[13-14]，接枝材料向上伸展，呈刷狀分布，平均高度約5 nm。通過接觸角測(cè)量儀對(duì)襯底表面的疏水性進(jìn)行表征，結(jié)果見表1。當(dāng)半胱胺或巰基丙酸接枝時(shí)間較短時(shí)，材料表面的接觸角在120°左右，疏水性較強(qiáng)；隨著半胱胺或巰基丙酸接枝時(shí)間的上升，材料表面的氨基/羧基濃度增加，其疏水性逐漸降低至親水，最終接觸角達(dá)到40°左右。因此，可以通過調(diào)整半胱胺或巰基丙酸的接枝時(shí)間，得到各種表面浸潤性不同的材料。

圖1 十八硫醇、半胱胺及3-巰基丙酸的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structuralformula of the octadecanethiol，cysteamine and 3-mercaptopropionic acid

圖2 接枝樣品形貌表征Fig.2 AFM images of the sample after graft modification

表1 不同接枝時(shí)間所得樣品接觸角Table 1 Contact angles on samples with different graft time

2.2 不同表面浸潤性材料對(duì)細(xì)菌粘附情況的影響

2.2.1 十八烷硫醇/半胱胺混合單分子層對(duì)細(xì)菌粘附情況的影響 作者選取3株菌株為食品中常見的有害菌株，也是目前生物膜研究中的典型菌株[15]。金黃色葡萄球菌常檢出于生肉、生乳及速凍食品中。而大腸桿菌是腸道中最普遍、數(shù)量最多的一類細(xì)菌，也是食品污染程度的重要參數(shù)指標(biāo)。牛奶是常見的易腐敗食品之一，控制牛奶腐敗的難點(diǎn)之一，即牛奶中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌生物膜的形成。銅綠假單胞菌形成生物膜，在日常食品檢測(cè)中，銅綠假單胞菌雖然不作為食品微生物檢驗(yàn)的常規(guī)指標(biāo)，但其已被確認(rèn)為食源性和水源性致病菌，易污染熟肉制品、涼拌即食食品，海鮮等食品。

在接觸角約為 118°、101°、74°、42°等表面浸潤性梯度變化的樣品表面進(jìn)行細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌作為細(xì)菌模型，其在材料表面的粘附情況見圖3。

圖3 利用十八硫醇/半胱胺制備的不同接觸角樣品上大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的粘附情況Fig.3 CLSM images of the E.coli，P.aeruginosa and S.aureus adhesion on the Octadecanethiol/cysteamine grafted samples with different contact angles

從圖3可以看出，當(dāng)材料表面疏水性較強(qiáng)時(shí)，在其表面粘附的3種菌較少；隨著材料表面疏水性的降低，3種細(xì)菌在其表面的粘附量均逐漸增加，尤其是當(dāng)材料表面從疏水轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水后，細(xì)菌的粘附量與疏水表面相比大為增加。另外，不同細(xì)菌在材料表面的粘附量存在一定差異，這主要是由于細(xì)菌自身的性質(zhì)不同所導(dǎo)致的，不同細(xì)菌的形狀、大小、表面電荷、表面疏水性、鞭毛性質(zhì)等都存在差異，使得粘附情況更為復(fù)雜。作者采用的金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌由于其尺寸較小，細(xì)菌莢膜、粘液、鞭毛等結(jié)構(gòu)完整，比大腸桿菌自聚及粘附能力更強(qiáng)，因此在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中粘附量更高。然而，即使自身性質(zhì)存在差異，不同細(xì)菌在表面浸潤性梯度變化的十八烷硫醇/半胱胺混合膜表面粘附情況變化的趨勢(shì)是一致的，表明材料表面的浸潤性是影響細(xì)菌粘附情況的重要因素，材料表面疏水性越強(qiáng)，抗細(xì)菌粘附的能力越強(qiáng)。

2.2.2 十八烷硫醇/巰基丙酸混合單分子層對(duì)細(xì)菌粘附情況的影響 為了進(jìn)一步驗(yàn)證表面浸潤性對(duì)細(xì)菌粘附情況的影響，我們用帶負(fù)電性基團(tuán)-COOH的巰基丙酸代替帶正電性基團(tuán)-NH2的半胱胺，與十八烷硫醇混合接枝到材料表面。不同表面浸潤性的十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜對(duì)三種細(xì)菌的粘附情況影響見圖4。可以看出，隨著材料表面浸潤性的變化，細(xì)菌在其表面的粘附量變化趨勢(shì)與在十八烷硫醇/半胱胺混合膜表面的變化趨勢(shì)相同，即隨著材料表面疏水性梯度性降低，細(xì)菌的粘附量逐漸增加，并且在親水表面的粘附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于疏水表面。

圖4 利用十八硫醇/3-巰基丙酸制備的不同接觸角樣品上大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的粘附情況Fig.4 CLSM images of the E.coli，P.aeruginosa and S.aureus adhesion on the on the octadecanethiol/3-mercaptopropionic acid grafted samples s with different contact angles

材料疏水性作為影響細(xì)菌粘附的重要性質(zhì)，一直是研究細(xì)菌粘附的重要考量因素。目前，許多研究團(tuán)隊(duì)開展了一系列著重于材料的親疏水性即浸潤性對(duì)細(xì)菌粘附影響的研究。Arima和Iwata[16]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能極強(qiáng)的粘附于接觸角在40～70°的聚合物表面。但Lee等人報(bào)道[17]細(xì)菌在PET（聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯）表面極易粘附及生長，尤其當(dāng)其接觸角達(dá)到最大值57°。此類相反結(jié)論的得出也說明關(guān)于疏水性對(duì)細(xì)菌粘附的影響仍有待探索。之后，Ronn[11]等人發(fā)現(xiàn)當(dāng)材料表面由非濕潤狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闈駶櫊顟B(tài)后，細(xì)菌粘附能力明顯增強(qiáng)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也從側(cè)面說明了疏水性強(qiáng)的材料能夠更有效的抑制細(xì)菌粘附。

2.2.3 材料表面電性對(duì)細(xì)菌粘附情況的影響 3種細(xì)菌在不同浸潤性的十八烷硫醇/半胱胺混合膜或十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜表面的覆蓋率變化趨勢(shì)見圖5。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，隨著表面疏水性的增加，細(xì)菌在材料表面的覆蓋率下降，并且同一種細(xì)菌在十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜表面的粘附量總是小于在十八烷硫醇/半胱胺混合膜表面的粘附量。這兩種混合膜的主要區(qū)別在于巰基丙酸含有負(fù)電性基團(tuán)-COOH，膜表面帶負(fù)電，而半胱胺含有正電性基團(tuán)-NH2，膜表面帶正電。可以推測(cè)，細(xì)菌在兩種混合膜表面粘附情況的差異與其帶電性有關(guān)。經(jīng)過測(cè)定，大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的表面電位分別為 （-25.01±2.18） mV、（-16.76±2.24） mV 和（-10.16±3.04） mV，均帶負(fù)電，其與十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜之間存在靜電排斥，與帶正電的十八烷硫醇/半胱胺混合膜相比，其對(duì)細(xì)菌的粘附有一定的抑制作用，進(jìn)一步加強(qiáng)了材料表面對(duì)細(xì)菌的抗粘附性。

圖5 大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌在不同浸潤性的十八烷硫醇/半胱胺混合膜或十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜表面的覆蓋率Fig.5 E.coli，P.aeruginosa and S.aureus coverage rate on grafted samples with different contact angles

3 結(jié)語

材料表面的不同性質(zhì)對(duì)細(xì)菌粘附情況的影響非常復(fù)雜。作者通過在材料表面接枝不同比例的十八烷硫醇/半胱胺，或十八烷硫醇/巰基丙酸混合單分子層，利用3種不同性質(zhì)的常見致病菌，研究材料表面浸潤性對(duì)細(xì)菌粘附情況的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著疏水性的增加，細(xì)菌在材料表面的粘附量逐漸降低，在疏水性材料表面的粘附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于親水性材料表面。另外，材料表面的帶電性也對(duì)其抗細(xì)菌粘附的能力有影響，由于大多數(shù)細(xì)菌的表面帶負(fù)電，其與同樣帶負(fù)電的表面之間存在靜電排斥，有利于提高材料表面的抗粘附性。這些結(jié)果能夠幫助理解細(xì)菌在材料表面粘附的內(nèi)在機(jī)理，同時(shí)有助于抗菌材料的設(shè)計(jì)和制備。