術(shù)前大黃素聯(lián)合順鉑化療對(duì)人食管鱗癌WIG—1mRNA的影響及其機(jī)制的研究

肖仁斌 彭輝 王江濤

[摘要]目的 探討術(shù)前大黃素聯(lián)合順鉑化療對(duì)人食管鱗癌野生型p53誘導(dǎo)基因1（WIG-1）mRNA的影響及機(jī)制。方法 選擇2017年3月～2018年10月我院收治的40例食管鱗癌患者作為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)術(shù)前病理組織檢查確診。患者確診后均給予大黃素聯(lián)合順鉑進(jìn)行術(shù)前化療，連續(xù)治療3個(gè)療程后對(duì)患者行手術(shù)治療，根據(jù)術(shù)中所取組織部位的不同，分為觀察組和對(duì)照組，每組各20例。觀察組術(shù)中取病灶組織，對(duì)照組術(shù)中取癌旁組織（距離腫瘤部位≥3 cm）。運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)測(cè)定兩組患者組織中的WIG-1mRNA表達(dá)水平和觀察組手術(shù)前后WIG-1mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 觀察組患者組織中的WIG-1mRNA表達(dá)水平為0.68±0.11，高于對(duì)照組的0.04±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；觀察組患者手術(shù)后食管鱗癌組織中的WIG-1mRNA表達(dá)水平為0.25±0.05，低于手術(shù)前的0.68±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 WIG-1mRNA在正常組織中表達(dá)水平較低，且術(shù)前大黃素聯(lián)合順鉑化療用于食管鱗癌患者中有助于降低WIG-1mRNA的表達(dá)水平，有助于改善患者的預(yù)后，能為食管鱗癌的治療提供分子學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]大黃素；順鉑化療；食管鱗癌；野生型p53誘導(dǎo)基因1mRNA表達(dá)；免疫組織化學(xué)法；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

[中圖分類號(hào)] R571 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）4（b）-0067-04

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of preoperative Emodin combined with Cisplatin on the expression of wild-type p53-induced gene 1 （WIG-1） in human esophageal squamous cell carcinoma. Methods Forty patients with esophageal squamous cell carcinoma admitted to our hospital from March 2017 to October 2018 were selected as subjects， all patients were diagnosed by preoperative pathological examination. Patients were given Emodin combined with Cisplatin for preoperative chemotherapy after diagnosis. After three consecutive courses of treatment， patients were operated on， according to the different tissues taken during the operation， patients were divided into observation group and control group， with 20 cases in each group. In the observation group， the lesion tissue was taken during the operation， while in the control group， the adjacent tissue was taken during the operation （distance from the tumor site （≥3 cm）. The expression of WIG-1 in tissues of the two groups and the expression of WIG-1 before and after operation in the observation group were measured by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results The expression level of WIG-1 in the observation group was 0.68±0.11， higher than 0.04±0.01 in the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression level of WIG-1 in esophageal squamous cell carcinoma tissues after operation in the observation group was 0.25±0.05， lower than 0.68±0.11 before operation， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The expression level of WIG-1 in normal tissues is low. Preoperative Emodin combined with Cisplatin chemotherapy is helpful to reduce the expression level of WIG-1 in esophageal squamous cell carcinoma patients， improve the prognosis of patients， and provide molecular basis for the treatment of esophageal squamous cell carcinoma.

[Key words] Emodin； Cisplatin chemotherapy； Esophageal squamous cell carcinoma； Wild-type p53-induced gene 1 mRNA expression； Immunohistochemistry； Reverse transcription-polymerase chain reaction technique

食管癌是一種起源于食管鱗狀上皮和柱狀上皮的惡性腫瘤，臨床上將其分為食管鱗癌與腺癌兩種，鱗癌占食管癌的90.0%[1]。食管鱗癌發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期，喪失了最佳根治時(shí)期。為了提高治愈率及生存率，食管鱗癌患者更多的以手術(shù)切除輔助化療、放療及免疫治療等綜合治療為主[2-3]。臨床研究顯示，術(shù)前化療在延長(zhǎng)食管癌患者的生存時(shí)間中，具有不可替代的作用[4]。順鉑是常用的廣譜化療藥物，能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。順鉑主要誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡反應(yīng)通路，一方面依賴p53，另一方面則依賴p73促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[5-6]。p53基因是目前發(fā)現(xiàn)的與人的腫瘤高度相關(guān)的基因，可以分為突變型p53與野生型p53兩種基因，前者參與了腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生并被后續(xù)的研究證明是一種腫瘤促進(jìn)因子，野生型p53基因則是一種抑癌因子[7]。野生型p53誘導(dǎo)基因1（wild-type p53-induced gene 1，WIG-1）是鼠類PAG608基因的人類同源體，能利用其特有的鋅指結(jié)構(gòu)與特定的蛋白、RNA及DNA等相結(jié)合，產(chǎn)生抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[8]。本研究采用隨機(jī)對(duì)照的方法，探討術(shù)前大黃素聯(lián)合順鉑化療對(duì)人食管鱗癌WIG-1mRNA的影響及機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2017年3月～2018年10月我院收治的40例食管鱗癌患者作為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)術(shù)前病理組織檢查確診。患者確診后均給予大黃素聯(lián)合順鉑進(jìn)行術(shù)前化療，連續(xù)治療3個(gè)療程后對(duì)患者行手術(shù)治療，根據(jù)術(shù)中所取組織部位的不同，分為觀察組和對(duì)照組，每組各20例。觀察組術(shù)中取病灶組織，對(duì)照組術(shù)中取癌旁組織（距離腫瘤部位≥3 cm）。

患者中，男25例，女15例；年齡48～83歲，平均（58.95±7.81）歲；腫瘤直徑1～8 cm，平均（4.23±0.77）cm。腫瘤部位：上段15例，中段20例，下段5例。臨床分期：Ⅱ期9例，Ⅲ期21例，Ⅳ期10例。本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合食管鱗癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)手術(shù)病理檢查確診者；②符合手術(shù)治療適應(yīng)證，術(shù)前均能耐受大黃素聯(lián)合順鉑化療者；③能遵醫(yī)囑完成相關(guān)檢查、治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、肝、腎等基礎(chǔ)疾病者；②合并精神異常或術(shù)前腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移者。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 超凈工作臺(tái)、CO2孵箱、低溫離心機(jī)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）儀、電泳儀、臺(tái)式高速低溫離心機(jī)、精密電子分析天平、平板電泳槽、電轉(zhuǎn)儀、紫外光分光光度計(jì)、電子pH測(cè)量?jī)x、冷藏冰箱、超低溫冰柜、普通光學(xué)顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋。

1.2.2試劑 Trizol分離試劑、免疫組化試劑盒（SP/9002）、DAB顯色試劑盒、蘇木素、Sangonone-step RT-PCR kit、RNA prep-DP401 total RNA minipreps super kit、TaqDNA聚合酶、牛血清白蛋白（BSA）、二硫蘇糖醇（DTT）、NC膜、十二烷基磺酸鈉、噻唑藍(lán)、二乙基焦碳酸、瓊脂糖、溴化乙錠。

1.3方法

所有患者均經(jīng)術(shù)前病理組織檢查確診。患者確診后均給予大黃素聯(lián)合順鉑術(shù)前化療。

1.3.1大黃素（Emodin，純度>98%）溶液的配制 用二甲基亞砜（DMSO）溶解，0.22 μm針頭濾器過(guò)濾除菌，使母液濃度為4 mg/ml，-20℃冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋到終濃度為30、60 μg/ml工作液[9-10]。

1.3.2病灶標(biāo)本采集 用無(wú)菌生理鹽水溶解，使DDP原液濃度為1 mg/ml，置于-20℃冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)同樣用完全培養(yǎng)基稀釋成終濃度為5、10 μg/ml工作液，連續(xù)進(jìn)行3個(gè)療程，療程完畢后對(duì)患者行手術(shù)治療，術(shù)中取病灶組織及癌旁組織[11]。

1.3.3 WIG-1mRNA的表達(dá) ①提取RNA并測(cè)定其濃度。取術(shù)前病灶組織與術(shù)中病灶組織，經(jīng)PBS沖洗后加入500 μl Trizol吹打，使組織充分溶解，加入500 μl Trizol充分混合、均勻。將上述溶液放入體溫5 min下使蛋白充分解體，加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，常溫下放置2～3 min，離心15 min，速度為12 000 r/min，獲得三層液體（上層為水相、中間層與下層為有機(jī)相）。取RNA沉淀，轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入0.5 ml異丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，離心10 min，速度為12 000 r/min，可見凝膠狀沉淀（即為RNA）。充分洗滌RNA，加入250 μl DEPC與750 μl乙醇，利用乙醇完成沉淀的沖洗后離心5 min，速度為7400 r/min，取沉淀放入工作臺(tái)干燥20 min。利用紫外分光度儀檢測(cè)RNA濃度并完成RNA提純（以Rnase作為空白對(duì)照），在A260下測(cè)定吸光度值。采用Dnase酶處理RNA，并完成RNA向cDNA的轉(zhuǎn)換，處理完畢后放入冰箱備用。②PCR反應(yīng)。檢測(cè)WIG-1及其下游基因mRNA的表達(dá)水平。WIG-1的上游引物為5′-CCAACTCCCTCCTCAGACCCG-3′；下游引物為5′-CCTGGGCAAATATACAGTCC-3′。β-actin鼠抗人單克隆抗體。β-actin上游引物為5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′。β-actin下游引物為5′-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3′；設(shè)定反應(yīng)條件為30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃下完成10 min延長(zhǎng)。取hGAPDH為內(nèi)參，選擇獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，放入1.5%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測(cè)定。β-actin為內(nèi)參[12-13]。