HPLC法測定蔬菜中3種喹諾酮類抗生素

羅 潔，羅 可，鄒小翠，彭敏婕，阮曉玲

（長沙醫學院，湖南長沙 410219）

0 引言

喹諾酮類抗生素（QNs）作為抗菌藥物被廣泛用于人和動物感染性治療中[1-2]。喹諾酮類抗生素使用后多以藥物原型或代謝產物隨尿糞排出，由于難以降解，成為有機環境污染物[3]，污染了水域[4-5]和土壤環境[6-7]，特別是在動物類食品中抗生素殘留污染問題尤為嚴重，且已經得到了社會的廣泛關注[8]。我國限定動物類食品中喹諾酮類抗生素（環丙沙星和恩諾沙星)最高殘留標準為（100 μg/kg）[9]。諾氟沙星（NOR）、環丙沙星（CIP）和恩諾沙星（ENR）是近年來較常見的3種人畜共用的QNs類抗生素，對該類抗生素在動物類食品中殘留的分析方法研究較多[10-11]，而在蔬菜中殘留的分析方法鮮有報道[12-13]。針對蔬菜中這3種喹諾酮類抗生素的檢測建立了較快捷、簡便的高效液相色譜（HPLC）分析方法，并采用該方法對市售蔬菜中此類抗生素污染及其對人體健康風險問題進行了探討，以期為蔬菜中喹諾酮類抗生素的檢測分析和健康風險評價提供更可靠的試驗依據。

1 儀器與試劑

LC-20A型高效液相色譜儀，島津公司產品；C18色譜柱，江蘇漢邦科技有限公司產品；BSA124S型分析天平，德國賽多利斯公司產品；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責任有限公司產品；AS系列超聲儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產品；ZWB-LS1-40型超純水機，湖南中沃水務環保科技有限公司產品。

諾氟沙星對照品（純度均>98%，批號D1712037）、恩諾沙星對照品（純度均>98%，批號C1731069）、環丙沙星對照品（純度均>98%，批號C1703096），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；乙腈（HPLC），天津康科德科技有限公司提供；磷酸（AR）、乙酸（AR），天津市恒興化學試劑制造有限公司提供；實驗室用水為超純水。

2 色譜條件

色譜柱為HederaODS-2 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈：0.1%甲酸水溶液（20∶80 V/V），流速1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫25℃，進樣體積20 μL。

3 溶液的配制

3.1 對照品溶液的制備

精密稱取諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星對照品約5 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，加入少量流動相配比溶液后超聲處理10 min助溶，流動相溶液定容，得質量濃度0.2 mg/mL的對照品儲備液；分別精密移取1 mL上述3種對照品溶液置于20 mL棕色容量瓶中，用流動相溶液定容至刻度，即得質量濃度0.01 mg/mL的混合對照儲備液于4℃下保存備用。

3.2 樣品前處理

用清水洗滌蔬菜樣本，再用實驗室自制超純水反復清洗3次，晾干后研磨粉碎。精密稱取約5 g置于燒杯中，加入20 mL提取液（乙酸∶乙腈4∶96，V/V），保鮮膜密封燒杯口，置于超聲儀中超聲提取15 min，取出靜置冷卻15 min，過濾，濾液置于蒸發皿中于90℃下蒸干，移取2 mL流動相溶液復溶，過0.45 μm微孔濾膜過濾，置于EP管中備用。

4 方法學驗證

4.1 專屬性試驗

取混合對照溶液和油麥菜樣品溶液各20 μL注入液相色譜儀中，在上述色譜條件下進行測定。諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星的保留時間分別為6.23，6.96，9.51 min，3種成分峰形較好、分離度良好。

3種抗生素對照品HPLC圖見圖1，油麥菜空白對照的HPLC圖見圖2。

4.2 標準曲線及定量限和最低檢測限

取10 g/mL混合對照溶液儲備液用空白蔬菜汁（上述前處理得到）與流動相的混合溶液稀釋，得到0.2，0.6，1.0，4.0，8.0，10.0 g/mL系列質量濃度混合對照液，分別取20 μL進行HPLC分析。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程和相關系數。以倍噪比（S/N=3）為最低檢測限LOD，以倍噪比（S/N=10）為定量限LOQ。

3種抗生素的線性關系、檢測限和定量限見表1。

圖1 3種抗生素對照品HPLC圖

圖2 油麥菜空白對照的HPLC圖

表1 3種抗生素的線性關系、檢測限和定量限

在0.3～10.0 g/mL質量濃度范圍內，3種喹諾酮類抗生素線性關系良好，相關系數均大于0.999；3種喹諾酮類化合物的檢出限為60～120 g/kg，定量限為180～360 g/kg。

4.3 精密度試驗

取已配置好的混合對照儲備液在上述條件下重復進樣6次，進樣20 μL，測得諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星的峰面積RSD值分別為0.47%，0.37%，0.39%，表明儀器精密度良好。

4.4 穩定性試驗

取已配置好的混合對照儲備液，按設定的色譜條件，分別于質量濃度0，0.5，1.5，3.0，5.0，8.0，10.0 g/mL進樣分析，測得3種成分的峰面積RSD值分別為1.39%，1.34%，1.70%，說明3種喹諾酮化合物在10 h內穩定性良好。

4.5 加樣回收率試驗

取“3.2”中的供試品勻漿5 g置于25 mL棕色容量瓶中，平行3份，加入標準限度100 μg/kg的喹諾酮抗生素對照品，分別進樣測定分析，計算回收率，得到各成分的加標回收率均在92%～94%，且RSD值均≤3%，證明該方法的回收率較好。

3種抗生素的加樣回收率試驗（n=3）見表2。

表2 3種抗生素的加樣回收率試驗（n=3）

4.6 不同種類蔬菜的回收率

不同品種蔬菜中的葉綠素、蛋白質、植物脂肪等物質的含量分布會對喹諾酮類抗生素的提取、凈化等效果造成一定影響。試驗僅對生菜、茼蒿和油麥菜中3種QNs類抗生素的加標（100 μg/kg）回收率進行檢測。加標回收試驗結果顯示，其中CIP的回收率均在80%左右，ENR在62%～65%，NOR均在70%以上。因此，該方法能夠適用于不同品種蔬菜中喹諾酮類抗生素分析檢測的要求。

5 實際樣品質量濃度測定

購買市場上3種不同蔬菜樣品，按照上述的樣品制備方法進行前處理后，在設定的色譜條件下測定蔬菜中3種喹諾酮類抗生素的質量濃度。

蔬菜中3種QNs類抗生素質量濃度測定結果見表3。

表3 蔬菜中3種QNs類抗生素質量濃度測定結果

在油麥菜未檢測出3種成分，在生菜及茼蒿中檢測到了一定量的環丙沙星和諾氟沙星，質量濃度在0.1～0.5 μg/mL，均超出了我國動物性食品中的最高殘留限量（100 μg/kg），由此可看出，蔬菜中的確含有該類喹諾酮類抗生素，且對人類健康存在隱患。所以，蔬菜等食品中QNs類抗生素的富集情況應該得以重視。

6 結果與分析

6.1 樣品前處理條件的選擇

6.1.1 提取液的選擇

對蔬菜（大白菜）樣品（5.0 g）以20 mL不同配比的提取液進行提取，繪制得到3種QNs類抗生素的加樣回收率。

提取液種類對喹諾酮類抗生素回收率的影響見圖3。

圖3 提取液種類對喹諾酮類抗生素回收率的影響

由圖3可知，3種不同配比的提取液對蔬菜中3種QNs類抗生素的加樣回收率均大于70%，其中提取液a對恩諾沙星和諾氟沙星的回收率差異不大，但這3種提取液中，提取液a對環丙沙星的回收率是最高的，且回收率在80%以上。因此選擇提取液a用于提取蔬菜樣品中的QNs類抗生素。

6.1.2 提取時間的選擇

提取時間往往直接決定提取液與固體顆粒的接觸面積和接觸程度，接觸面積愈大且接觸程度越好，則提取效率愈高。但試驗結果表明，當提取時間超過15 min后，提取時間對提取效果的影響并不大。所以，選擇15 min作為提取時間。

提取時間對喹諾酮類抗生素回收率的影響見圖4。

圖4 提取時間對喹諾酮類抗生素回收率的影響

6.2 流動相的選擇

喹諾酮類抗生素的流動相的pH值與解離狀態。在強酸介質（pH值＜3）中，QNs類抗生素為強陽離子；當pH值為3～4時，QNs類抗生素則呈兩性離子形式；但當pH值為中性時，QNs類抗生素又表現為弱陰離子；且在堿性條件下，QNs類抗生素為陰離子形式。所以，流動相的pH值對QNs類抗生素在色譜柱上的保留時間和分離度有較明顯的影響，試驗表明流動相中加一定酸性溶液，這3種QNs類抗生素的峰形會得到改善。所以，選擇以乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，并使用等度洗脫方式來實現3種QNs類化合物的良好分離。