番石榴黃酮類提取物的保鮮應用

曹湛慧，黃 和，2，劉子聰，程嘉怡

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學分析測試中心，廣東湛江 524088）

番石榴（Psidium guajava L.）屬于桃金娘科番石榴屬，廣泛種植在廣東、廣西、海南、江西等地區，全年可采摘[1]。黃酮是一類分布廣泛、備受關注的天然多酚類物質[2]。經研究發現，黃酮類化合物具有降血糖、清除自由基、防治心腦血管疾病、保肝、抗菌等功效[3]，現廣泛被應用于醫療、保鮮、食用等領域。

根據國內外研究資料顯示，絕大部分都在研究番石榴葉黃酮類提取物的活性、應用等，對于番石榴果實中黃酮類物質的提取及應用研究較少，張云竹等人[4]對番石榴中總黃酮的提取工藝進行優化研究。彭財英等人[5]采用正反相硅膠、凝膠、微孔樹脂柱色譜、薄層色譜等手段分離，波譜法對番石榴果實中黃酮類成分進行研究。Luximon R A等人[6]研究發現，不同品種番石榴的黃酮類物質都具有有效的抗氧化能力。目前，將番石榴黃酮進行水產品保鮮研究尚未見報道。

試驗通過超聲波提取番石榴果實中黃酮類物質，采用聚酰胺柱層析柱對黃酮類粗提物進行純化，將粗提物及純化物應用于蝦肉糜、魚肉糜的保鮮研究中，以期為番石榴黃酮在水產品的保鮮應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番石榴、新鮮的對蝦、羅非魚，購于湛江沃爾瑪超市，產地湛江。

蘆丁，標準品，中國食品藥品檢定研究所提供；聚酰胺粉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1901型紫外可見分光光度計，廣州市深華生物技術有限公司產品；KQ-500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司產品；LSB50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司產品；SPX-250B-Z型生化培養箱，上海高致精密儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 番石榴黃酮類物質提取工藝流程

番石榴→清洗、削皮、打漿→超聲波輔助提取（料液比1∶25，乙醇體積分數60%，超聲功率350 W，提取時間30 min）→過濾、離心（8 000 r/min，10 min）、濃縮→黃酮粗提物→裝柱、純化→黃酮純化物。

1.3.2 黃酮類物質含量的測定

采用NaNO2-Al（NO3）3比色法，番石榴黃酮的提取參照文獻[7-8]。

1.3.3 層析柱制備

層析柱材料的預處理：用95%的乙醇溶液浸泡聚酰胺粉和棉花24 h，使用前不斷攪拌，直至沒有氣泡冒出。將少許棉花制成層析柱內徑大小、厚度適中的薄層圈，用浸泡液使其平鋪在層析柱底部，再沿著玻璃棒將預處理的聚酰胺粉加入到層析柱里至容積的2/3，輕敲柱子使聚酰胺粉間無氣泡，用3倍柱體積的95%乙醇溶液洗滌，直至洗出液澄清并在蒸干后無任何殘留為止，再用3倍柱體積的5%氫氧化鈉、1倍柱體積的蒸餾水和3倍柱體積的10%醋酸洗滌，然后用蒸餾水洗滌，直至洗出液呈中性，備用[9]。

1.3.4 樣品的分離純化

（1）分離純化流程。移適量的番石榴黃酮粗提物置于層析柱中，待樣液完全加入到層析柱后，加少量蒸餾水至洗出液澄清，最后用體積分數70%乙醇洗滌[10]。用活塞控制洗脫速度為每滴間隔5 s，每20 mL收集 1次。將洗脫起點與終點間所收集的洗脫液合并，并置于旋轉蒸發儀中進行濃縮，至與進樣體積相同，于4℃下保存，備用。

（2）洗脫起點與終點的判斷方法。洗脫起點與終點的判斷：從不同的收集杯中吸取1 mL收集液于小試管中，用膠頭滴管移入3～4滴1%的三氯化鐵，充分搖勻[11]。若反應液呈綠色，則表明洗出液中含有目標化合物；若溶液呈黃棕色，則不含目標化合物。

1.3.5 番石榴黃酮類提取物的保鮮應用

（1）樣品的制備。對蝦去殼、沖洗干凈后絞碎，制成蝦糜，備用。

羅非魚去鱗、去頭、去尾、去內臟后，反復沖洗干凈后絞碎，制成魚糜，備用。

空白對照組（CK）：稱取每份250 g的蝦肉糜和魚肉糜分別置于燒杯中，移入10 mL蒸餾水并充分均質，立即用保鮮膜密封，于4℃下冷藏保存，備用。

試驗組：準確稱取3份250 g的蝦肉糜和3份250 g的魚肉糜分別置于不同的燒杯中，每份蝦肉糜和魚肉糜分別加入10 mL預先配制的質量分數為0.5%的番石榴黃酮粗提物、0.5%的番石榴黃酮純化物、0.15%的山梨酸鉀溶液，并充分均質，迅速用保鮮膜密封，于4℃下冷藏保存，備用。

（2）感官評價。蝦肉糜的感官評價方法借鑒水產品行業中《凍蝦仁》的標準，而魚肉糜借鑒陳曉眠等人[12]《殼聚糖和茶多酚對羅非魚冷藏保鮮效果比較》的方法。隨機挑選5人組成固定的評分小組，每2 d分別對每組蝦肉糜、魚肉糜的感官進行評分。評定標準分5個等級。每個人在單獨情況下根據外觀、肉質和氣味對應的分值獨立給出各項評價分值[13]。

蝦肉糜感官評價標準見表1，魚肉糜感官評價標準見表2。

表1 蝦肉糜感官評價標準

表2 魚肉糜感官評價標準

（3）pH值的測定。采用酸度計法，從空白對照組和試驗組中稱取蝦肉糜、魚肉糜各10 g，分別移入100 mL蒸餾水，使其均質1 min，放置30 min后進行測定[14]。每個樣品平行測定2次，每隔2 d測定1次。

（4）揮發性鹽基氮（TVB-N）值的測定。參照水產標準SC/T 3032—2007《水產品揮發性鹽基氮的測定》[15]的方法。

（5）菌落總數的測定。參照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗菌落總數測定》[16]執行。

2 結果與分析

2.1 黃酮類粗提物定性檢測

硝酸鋁反應：將樣品提取液中加入2%硝酸鋁溶液，樣品液顯示為黃色；鹽酸鎂粉反應：將樣品提取液中加入少量鎂粉，再加2滴鹽酸，樣品液顯示為橙紅色；三氯化鐵反應：將樣品提取液中加入數滴1%三氯化鐵溶液，樣品液顯示為灰綠色。這都是黃酮類化合物的特征顏色反應現象，最終確定樣品溶液中含黃酮類化合物。

2.2 黃酮類粗提物和純化物的濃度計算

稱取200 g番石榴果皮漿，經過提取、濃縮，分離純化得到各500 mL的粗提物和純化物。利用蘆丁標準曲線計算樣品中總黃酮含量。測得黃酮類粗提物和純化物的質量濃度分別為0.442，0.540 mg/mL。

2.3 番石榴中黃酮類物質的保鮮應用

2.3.1 感官評分的變化

食品感官評分是通過對食品的色澤、質地、氣味等進行評價打分。感官指標分值是評價食品最方便直觀、簡單準確的指標[17]。

蝦肉糜在4℃條件下的感官評分變化見圖1，魚肉糜在4℃條件下的感官評分變化見圖2。

圖1 蝦肉糜在4℃條件下的感官評分變化

從圖1和圖2可以看出，蝦肉糜、魚肉糜的品質隨著貯藏時間的延長，感官評分都呈下降的趨勢。對于蝦肉糜，前2 d空白對照組和試驗組的感官評價值沒有明顯的區別；從4 d起，空白對照組的蝦肉糜顏色漸漸變黃，有黑點，表面出現黏液且有腐敗氣味，而試驗組的蝦肉糜感官品質的下降相對緩慢。對于魚肉糜，前4 d每個組的感官評分差異較小；而從6 d起，相比空白對照組，純化物、粗提物處理過的魚肉糜，與山梨酸鉀一樣能有效地使感官品質下降趨勢減緩。這表明，黃酮粗提物、純化物抑菌作用好。

2.3.2 pH值的變化

鮮蝦、活魚死后由于肉質中糖原發生反應而生成大量的酸性物質，致使蝦肉糜、魚肉糜的pH值下降，而隨著貯藏時間的延長，蝦肉糜、魚肉糜中的含氮物質容易被腐敗菌吸收利用，產生堿性物質，使蝦、魚肉糜中pH值上升[18]。

蝦肉糜在4℃條件下pH值的變化見圖3，魚肉糜在4℃條件下pH值的變化見圖4。

圖2 魚肉糜在4℃條件下的感官評分變化

圖3 蝦肉糜在4℃條件下pH值的變化

圖4 魚肉糜在4℃條件下pH值的變化

從圖3和圖4可以看出，在保鮮過程中，每個空白對照組和試驗組的pH值變化趨勢呈相同的變化規律，其中空白對照組的pH值變化趨勢比試驗組尤為明顯，這表明黃酮類粗提物、純化物與山梨酸鉀同樣具有一定的保鮮能力。在每個試驗組中，用純化物浸泡過的蝦肉糜、魚肉糜pH值變化趨勢較接近山梨酸鉀，并比粗提物的變化程度慢，表明黃酮純化物更能有效地抑制微生物的生長。

2.3.3 揮發性鹽基氮（TVB-N）值的變化

TVB-N是水產品在貯藏過程中，肉質中蛋白質由于酶和細菌的作用而被轉化成胺類等堿性含氮物[19]，TVB-N值已廣泛成為評價水產品鮮度的重要方法之一。

蝦肉糜在4℃條件下TVB-N值的變化見圖5，魚肉糜在4℃條件下TVB-N值的變化見圖6。

圖5 蝦肉糜在4℃條件下TVB-N值的變化

圖6 魚肉糜在4℃條件下TVB-N值的變化

從圖5和圖6可以看出，整個試驗過程中，TVB-N值的變化呈現出上升的趨勢。對于蝦肉糜，前4 d空白對照組和試驗組的TVB-N值變化差異較小，接著空白對照組TVB-N值的遞增趨勢明顯，而對于魚肉糜；從6 d起，與各個試驗組相比，空白對照組TVB-N值的變化趨勢非常明顯，說明相同保鮮條件下，魚肉糜比蝦肉糜有更長的保鮮期。在各個試驗組中，粗提物、純化物和山梨酸鉀的TVB-N值上升趨勢較為緩慢，且在貯藏期的6 d，用粗提物、純化物和山梨酸鉀處理過的蝦肉糜與魚肉糜TVB-N值分別是27.49，23.21，20.24，23.50，20.39，19.93 mg/100 g，證明粗提物和純化物具有一定的抑菌作用，純化物抑菌效果比粗提物要好。

2.3.4 菌落總數對數值的變化

水產品的腐敗變質大部分由于微生物的生長繁殖引起，其腐敗程度主要取決于微生物的繁殖速度，因而菌落總數能夠成為衡量水產品鮮度的一項重要指標[20]。

蝦肉糜在4℃條件下菌落總數對數值的變化見圖7，魚肉糜在4℃條件下菌落總數對數值的變化見圖8。

圖7 蝦肉糜在4℃條件下菌落總數對數值的變化

圖8 魚肉糜在4℃條件下菌落總數對數值的變化

從圖7和圖8可以看出，無論是蝦肉糜還是魚肉糜，空白對照組的菌落總數比每個試驗組多，且上升幅度比相同保鮮期的試驗組顯著。對于蝦肉糜，空白對照組3 d就達到1×106，用粗提物、純化物和山梨酸鉀處理過的蝦糜分別是5，7，8 d達到1×106，對于魚肉糜，空白對照組4 d達到1×106，用粗提物、純化物和山梨酸鉀處理過的蝦糜分別是6，7，9 d達到1×106。這表明粗提物、純化物具有一定的抑制微生物生長繁殖的能力，且黃酮純化物抑菌效果優于粗提物。

3 結論

采用超聲波輔助法提取番石榴果皮中黃酮類物質，經過提取、濃縮、分離純化，得到粗提物和純化物。通過計算黃酮類粗提物和純化物的質量濃度分別為0.442，0.540 mg/mL。

以0.15%的山梨酸鉀為陽性對照，以感官評價、pH值、揮發性鹽基氮值和菌落總數為評價指標，將番石榴黃酮類粗提物和純化物在4℃保鮮條件下保鮮蝦肉糜、魚肉糜。結果表明，0.5%番石榴黃酮類粗提物和純化物能有效減緩蝦肉糜、魚肉糜的品質下降進程，降低揮發性鹽基氮值，抑制腐敗菌的增長，延長蝦肉糜、魚肉糜的保質期。番石榴黃酮類純化物保鮮效果優于粗提物，可作為一種天然防腐劑使用。