UPLC-MS/MS法測定阿膠糕中6種黃曲霉毒素的方法

周艷華，李濤*，潘小紅

1. 長沙環境保護職業技術學院（長沙 410004）；2. 湖南省食品質量監督檢驗研究院（長沙 410111）

阿膠糕屬于藥食同源產品，是用阿膠、黑芝麻、核桃仁、枸杞、冰糖、黃酒等制作出的保健食品，具有補血養氣、美容養顏、潤腸通便、提高免疫力的綜合保健功效，近年來越來越受到消費者的青睞，阿膠糕類產業規模不斷擴大，阿膠糕的質量安全也越來越受到重視[1-2]。黃曲霉毒素（Aflatoxins，以下簡稱AF）是生長在食物及飼料中的黃曲霉和寄生曲霉代謝的一組化學結構類似的產物，AF具有強毒性和致癌性，世界衛生組織國際癌癥研究機構將AF列入Ⅰ類致癌物清單[3-4]。據研究表明，AF在飼料、糧油產品、堅果及籽類（特別是花生、核桃、芝麻）、調味品、乳制品中檢出率較高[5-8]。阿膠糕中含有多種易產生AF的原料，因此加強阿膠糕中AF的監測具有重要意義。目前，AF的檢測方法主要包括薄層色譜法（TLC）、酶聯免疫法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）等[9-11]，其中TLC分離效果差、準確度和靈敏度低；ELISA易出現假陽性；HPLC法使用熒光檢測器檢測，專屬性不強，易出現假陽性結果，對于基質較為復雜樣品，如蜂膠等保健食品，仍會出現回收率低、不易分離等問題。超高壓液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）因其高準確度和高靈敏度成為一種理想的檢測方法。試驗采用UPLC-MS/MS同時測定保健食品阿膠糕中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2，為保健食品中6種AF的同時快速檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-30超高壓液相色譜儀，日本島津公司；API 4500型串聯質譜儀，美國AB Sciex公司；BS 224 S電子分析天平，德國賽多利斯公司；TG 16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μ m）、Hypersil Gold C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm），美國Thermo Fisher公司；XB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μ m），月旭科技上海股份有限公司。

HLB固相萃取小柱（60 mg/3 mL）、C18固相萃取小柱（60 mg/3 mL），美國Waters公司；AF免疫親和柱（B1、B2、G1、G2、M1、M2），北京華安麥科公司；M226 Aflazon凈化柱，Romer Labs公司；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混合標準溶液及AFM1、AFM2，美國O2si公司；乙腈、甲醇，均為色譜純，德國Meker公司；甲酸、乙酸銨，均為分析純，上海國藥。女士型阿膠糕、即食阿膠糕、桃花阿膠糕囊，市售。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C8色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：5 μL：流動相：A為0.1%甲酸水溶液，C為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

1.3 質譜條件

電離方式：ESI，正離子模式掃描，氣簾氣25 Psi，鞘氣38 Psi，輔助氣40 Psi，碰撞氣中等，離子化電壓5 500 V，霧化溫度550 ℃；多反應監測掃描（MRM）采集參數見表2。

表2 液質采集參數表

1.4 樣品預處理

準確稱取5.0 g粉碎混勻的樣品，加入1.0 g氯化鈉和25 mL 84%乙腈水溶液，振搖提取30 min，于6 000 r/min離心10 min，取5.0 mL上清液，加入50.0 mL 10%吐溫20 PBS緩沖液，混勻，于6 000 r/min離心5 min，離心后上清液過柱，用4.0 mL甲醇洗脫后氮吹干，用1.0 mL流動相復溶后，供液質聯用儀分析。

2 結果與分析

2.1 色譜柱選擇

在相同條件，分別研究了Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）、Hypersil Gold C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）、XB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）測定相同濃度的混合標準溶液。GOLD C8柱較GOLD C18柱對AF的分離效果更好，GOLD C8柱較XB-C18有更高的靈敏度，填料粒徑為1.8 μm的色譜柱工作壓力較大，并易出現壓力波動，引起保留時間漂移。因此采用Hypersil Gold C8（150 mm×2.1 mm，3 μm）色譜柱效果更佳。圖1為標準溶液的多反應監測（MRM）TIC圖，圖2為加標樣品多反應監測（MRM）TIC圖。

圖1 Gold C8色譜柱分離標準溶液的多反應監測（MRM）TIC圖

圖2 Gold C8色譜柱分離加標樣品的多反應監測（MRM）TIC圖

2.2 凈化柱效果評價

在相同條件下，分別研究了HLB凈化柱、C18凈化柱、M226凈化柱和免疫親和柱對阿膠糕提取液中AF凈化效果，以回收率為評價指標，4種凈化柱回收率見表3。由表3可見，HLB凈化柱對阿膠糕中AF凈化后回收率在54.7%～86.3%之間，C18凈化柱對阿膠糕中AF凈化后回收率在51.1%～83.5%之間，M226凈化柱對阿膠糕中AF凈化后回收率在57.7%～73.3%之間，免疫親和柱對阿膠糕中AF凈化后回收率在86.8%～100.9%之間，說明免疫親和柱具有良好的回收率，凈化效果最好。因此選取免疫親和柱作為測定阿膠糕中AF的凈化柱。

表3 4種凈化柱對阿膠糕中AF凈化回收率

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

5.0，10.0，15.0，20.0和40.0 ng/mL，AFB2、G2濃度為0.15，0.30，0.6，1.5，3.0，4.5，6.0和12.0 ng/mL，以峰面積的響應值Y為縱坐標，標準溶液濃度X（ng/mL）為橫坐標，外標法制作標準曲線。基質空白響應值的2～3倍對應濃度的混合標準溶液AFB1、AFG1、AFM1、AFM2濃度為0.5 ng/mL，AFB2、AFG2濃度為0.15 ng/mL，平行測定11次，根據檢出限的計算方法LOD=3SD/b和LOQ=10SD/b（SD為標準偏差，b為工作曲線斜率），當取樣量為5.0 g，定容體積為5.0 mL時，6種AF線性方程、相關系數、方法檢出限和定量限見表4。由表4可知，AFB1、AFG1、AFM1、AFM2在0.5～40 ng/mL濃度范圍內，AFB2、AFG2在0.15～12.0 ng/mL濃度范圍內，線性關系良好，線性回歸系數均在0.999以上。各組分的檢出限在0.07～0.03 μg/kg之間，定量限在0.02～0.15 μg/kg之間。

表4 6種AF的線性方程和相關系數

2.4 準確度和精密度

在空白阿膠糕樣品中加入混合標準溶液，加標后樣品濃度分別為1.0，2.0和10.0 μg/kg，每個濃度樣品制備6份，測定6種AF的濃度，計算回收率和RSD值。由表5可知，當加標濃度為1.0 μg/kg時，回收率在69.2%～84.1%之間，精密度RSD為1.2%～4.1%；當加標濃度為2.0 μg/kg時，回收率在73.7%～90.1%之間，精密度RSD為2.2%～4.1%；當加標濃度為10.0 μg/kg時，回收率在76.3%～106.7%之間，精密度RSD為0.9%～4.0%。

表5 6種AF回收率和精密度

2.5 實際樣品的檢測

按擬定方法測定3種保健食品阿膠糕，女士型阿膠糕和桃花阿膠糕均未檢出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2；即食阿膠糕檢出AFB1，其含量為0.47 μg/kg，小于規定限量值，樣品中AFB1定量離子色譜圖見圖3。

圖3 樣品中AFB1定量離子色譜圖

3 討論與結論

保健食品阿膠糕是高蛋白、高脂肪、高糖分的混合體，在一定的環境下極易產生AF。食品中AFB族和G族提取劑通常選擇70%的甲醇或84%的乙腈，AFM族提取劑通常選擇甲醇，基于保健食品阿膠糕的特殊基質，試驗采用84%的乙腈作為提取劑，乙腈具有沉淀蛋白的作用，利用AF充分溶解進入提取液，也有利于AF的凈化。

通過使用多種凈化柱進行凈化，結果表明，僅使用免疫親和柱時6種AF都具有較高回收率，免疫親和柱利用高特異性抗體與提取液中AF結合保留在親和柱中，其他雜質則隨提取液流出。當凈化液中有機相超過一定比例時，免疫親和柱中抗體無法全部與提取液中AF進行結合，會產生回收率低的現象，因此在凈化前，需采用10%吐溫20 PBS緩沖溶液進行稀釋，可有效提升AF的回收率和凈化效果。免疫親和柱的高特異性和高靈敏度，十分適合阿膠糕這種基質復雜的保健食品。

此研究利用超高效液相色譜-串聯質譜儀建立了保健食品阿膠糕中6種AF的快速檢測方法。色譜條件：Hypersil Gold C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；正離子模式，使用0.1%甲酸水溶液和乙腈進行梯度洗脫，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃。結果表明：6種AF在0.15～40.0 ng/mL濃度范圍內具有良好的線性關系（線性相關系數均大于0.999），各組分的檢出限在0.07～0.03 μg/kg之間，定量限為0.02～0.15 μg/kg。當加標濃度為1.0～10.0 μg/kg時，回收率在69.2%%～106.7%之間，精密度在0.9%～4.1%之間。該方法快速、簡便、可靠，應用于實際樣品檢測重現性良好，可為阿膠糕及其它保健食品中AF的快速檢測提供參考依據。