HPLC法測定紫花地丁中香豆素和黃酮的量

徐小博，任敏，何松林，賈文慶*，趙坤，劉會超

1. 新鄉學院生命科學技術學院（新鄉 453003）；2. 河南科技學院園藝園林學院（新鄉 453003）；3. 河南科技學院動物科技學院（新鄉 453003）

紫花地丁（Viola yedoensis Makino）為堇菜科植物紫花地丁的干燥全草，味苦、辛，性寒，歸心、肝經，具有清熱解毒、涼血消腫的功效，用于治療黃疸內熱、疔瘡腫毒、喉痹腫痛等疾病[1-3]，具有重要的食用、藥用價值和觀賞價值。現代藥理研究表明，其具有抗菌、抗炎、抗HIV、抗凝血、調節免疫等作用[4-6]。臨床上多應用于治療痢疾、黃疸、咽炎、乳房炎和組織炎等多種病癥[7-8]。香豆素類、黃酮類以及有機酸是紫花地丁最為重要的活性成分[9-12]。

目前，對紫花地丁藥理性和化學成分研究較多，而對其主要成分進行定量分析較少。僅有高意等[13]、陳胡蘭等[14]、孟繁姝等[15]利用高效液相法分別測定了紫花地丁中秦皮乙素、槲皮素、芹菜素和木犀草素的含量。目前，利用高效液相色譜法同時測定紫花地丁中多種黃酮和香豆素活性成分的文獻尚未見報道。此外，有報道稱：從紫花地丁水溶性部位中分離鑒定了秦皮甲素[16]，秦皮甲素具有抗炎、抗菌、抗血凝、抗腫瘤等重要功能[17]，在前期試驗中發現紫花地丁中秦皮甲素含量也較高，但紫花地丁中秦皮甲素的定量分析尚未見報道。該研究利用高效液相色譜法對紫花地丁全株和花器官中6種黃酮和香豆素類化合物的含量進行測定，為紫花地丁品質控制和評估提供新的參考依據，也為紫花地丁應用于醫藥、食品、化妝品提供參考。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

紫花地丁全草于2017年5月采于河南科技學院花卉基地，紫花地丁的花于2017年4月采于河南科技學院花卉基地，經賈文慶副教授鑒定為紫花地丁V.yedoensis。樣品自然陰干，粉碎后過40目篩，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2 試劑與設備

秦皮甲素對照品（批號110885-200102）、秦皮乙素對照品（批號110753-201716）、蘆丁對照品（批號111720-169050）、木犀草素對照品（批號110875-128789）、柚皮素（批號110875-393138）和木犀草苷對照品（批號111720-201609），百靈威科技有限公司；甲醇和乙腈，均為色譜純，美國Fisher有限公司；試驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

LC-20 A高效液相色譜儀（日本島津公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；RE-3000旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；十萬分之一天平（梅特勒）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3 C18（5 μ m，250 mm×4.6 mm）；流動相：以乙腈流動相為A，以15 mmol/L醋酸銨水溶液為流動相B。梯度洗脫：0～10 min，流動相A 10%～25%；10～20 min，流動相A 25%～60%。流量，1 mL/min；進樣量，10 μL；柱溫，30 ℃；檢測波長，290 nm。混合對照品色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取5 mg秦皮甲素、5 mg秦皮乙素、5 mg蘆丁、5 mg木犀草苷、5 mg木犀草素、2.5 mg柚皮素，加入60%甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶，混勻。制成質量濃度分別為500，500，500，500，500和250 μg/mL對照品溶液。分別準確量取2.0，2.0，1.0，1.0，1.0和1.0 mL 6種對照品溶液于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得到混合對照品溶液，置于4℃冰箱中避光保存。

2.3 供試品溶液的制備

精準稱量0.5 g樣品粉末，加入50 mL提取溶劑（70%乙醇）。超聲（功率250 W，頻率35 kHz）提取40 min，重復提取操作3次，將3次的提取液合并。提取液在50 ℃下減壓濃縮，濃縮液用超純水定容到25 mL，避光置于4 ℃冰箱待用。進樣前用0.45 μm的濾膜過濾。

2.4 線性關系的考察

8個濃度級別的對照品混合液按2.1方法檢測。以樣品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到6個化合物的線性回歸方程。回歸方程及線性范圍見表1。結果表明：各對照品在各自濃度范圍內線性關系良好。

圖1 混合對照品色譜圖

表1 6種化合物的線性關系考察結果

2.5 精密度試驗

取2.2混合對照品溶液，以10 μL進樣量，連續進樣6次，計算得秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素峰面積的RSD，分別為2.22%，0.67%，1.63%，1.28%，0.77%和1.67%，結果表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取紫花地丁樣品，按2.3制備供試品溶液，分別在0，2，4，8，12和24 h進樣，按2.1方法測定峰面積，結果顯示秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素峰面積的RSD分別為0.77%，1.64%，0.84%，0.89%，1.94%和0.66%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取同一批紫花地丁全株樣品，精密稱取6份1.0 g的樣品，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1方法測定樣品中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量，測得6個化合物含量的RSD分別為0.38%，0.46%，1.05%，1.34%，1.21%和0.92%，表明重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取0.5 g紫花地丁樣品6份，分別按表2添加低濃度、中濃度、高濃度的6種對照品，然后制備紫花地丁的提取液，得到分析峰面積后算出加標回收率，見表2。6個化合物的加標回收率介于91.18%～99.92%的范圍內。

表2 紫花地丁中6種化合物的回收率試驗結果

2.9 樣品測定

取紫花地丁全株和花器官樣品，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定，利用回歸方程計算出紫花地丁全株樣品中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量，分別為2 406，2 961，887，1 371，382和165 mg/kg，花器官中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量分別為4 345，5 665，587，871，582和465 mg/kg。

圖2 紫花地丁全株（A）和花（B）的液相色譜圖

3 結論與討論

比較了甲醇-磷酸緩沖液、甲醇-醋酸銨緩沖液、乙腈-磷酸緩沖液、乙腈-醋酸銨緩沖液系統的分離效果，考察被測組分與雜質峰的分離情況及信號響應，最終優化流動相為乙腈和15 mmol/L醋酸銨水溶液梯度洗脫，可使各成分達到理想的分離，且峰形較好，基線平穩。

關于檢測波長的選擇，藥典中蘆丁的檢測波長為260 nm，木犀草素和芹菜素在270和350 nm有最大吸收，周桂芬等[18]選擇用290 nm檢測鐵皮石斛中的柚皮素含量，該試驗前期比較270，290，310和330 nm波長對樣品的檢測。結果表明：當波長為290 nm時，各組分均有較強的吸收強度，故試驗最終選擇以290 nm為試驗最佳波長條件。

該研究建立HPLC同時測定紫花地丁全株和花器官中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素含量的檢測方法，該方法操作簡便，專屬性強，可為紫花地丁的品質評價提供依據。

通過對樣品的檢測結果發現紫花地丁全株樣品中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量分別為2 106，2 961，887，1 371，382和165 mg/g，兩種香豆素含量高于四種黃酮含量，四種黃酮中木犀草苷的含量最高；紫花地丁花器官種中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量分別為4 345，5 665，587，871，582和465 mg/g。紫花地丁全株和花器官中秦皮甲素含量雖然均低于秦皮乙素含量，但是高于被檢測4種黃酮的含量。秦皮甲素具有抗炎、抗菌、抗血凝、鎮痛等活性，可抑制大鼠眼晶狀體的醛糖還原酶，是枯草桿菌的生長抑制劑，同時對化學性致癌亦有抑制作用[19-20]。因此在利用紫花地丁時，不能忽視秦皮甲素的作用。花器官中秦皮甲素和秦皮乙素含量均高于全株的，表明花可能具有更高的藥用價值。