玉米低聚肽中抗氧化肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

周明，秦修遠(yuǎn)，賈福懷，袁媛，谷瑞增，劉文穎*

1. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）；2. 寧波御坊堂生物科技有限公司（寧波 315012）

自由基是生物體內(nèi)在生命活動(dòng)過(guò)程中反應(yīng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)與多種疾病密切相關(guān)，某些炎癥、癌癥及心血管疾病的起始期都與活性氧自由基有關(guān)。通過(guò)膳食補(bǔ)充抗氧化劑能有效清除自由基，達(dá)到預(yù)防疾病和延緩人體衰老的目的[1-2]。很多人工合成的抗氧化劑如BHA、BHT，雖然抗氧化效果很好，但對(duì)人體有潛在的毒副作用，因此，近年來(lái)尋找天然安全的生物抗氧化劑成為國(guó)內(nèi)外的研究重點(diǎn)[3]。天然抗氧化肽因具有較強(qiáng)的活性和很高的安全性，已成為目前的研究熱點(diǎn)。

玉米低聚肽是以玉米黃粉為原料，經(jīng)過(guò)酶解、分離、精制等過(guò)程而得到的相對(duì)分子質(zhì)量低于1 000 U的肽類混合物。玉米低聚肽具有多種生物功能，如抗氧化、促進(jìn)酒精代謝、降血壓等[4-6]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)玉米低聚肽的抗氧化活性缺乏深入和系統(tǒng)的研究，并且發(fā)揮作用的具體活性肽段的結(jié)構(gòu)并不明確。試驗(yàn)以玉米黃粉為原料，通過(guò)堿性蛋白酶、中性蛋白酶兩步酶解法制備出玉米低聚肽，在對(duì)其基礎(chǔ)理化成分進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，以反相高效液相色譜（RP-HPLC）、四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF MS）為檢測(cè)手段，對(duì)玉米低聚肽中的抗氧化肽段進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，以期明確玉米低聚肽中抗氧化肽的活性及其結(jié)構(gòu)，為玉米低聚肽在抗氧化保健食品的開(kāi)發(fā)提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

玉米黃粉（北京中食海氏生物技術(shù)有限公司）；堿性蛋白酶、中性蛋白酶（諾維信生物技術(shù)有限公司）；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法），碧云天生物技術(shù)研究所；乙腈（美國(guó)Fisher公司，色譜純）；三氟乙酸（英國(guó)Alfa Aesar公司，分析純）。

1.1.2 設(shè)備與儀器

GSY-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）；YG 30噴霧干燥機(jī)（無(wú)錫市陽(yáng)光干燥設(shè)備廠）；QSY-2型凱氏定氮儀（北京強(qiáng)盛分析儀器制造中心）；LC-20 AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Spectra MR酶標(biāo)儀（美國(guó)DYNEX公司）；Q-TOF 2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀（英國(guó)Micromass公司）。

1.2 方法

1.2.1 玉米低聚肽的制備

將玉米黃粉溶解于蒸餾水中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)15 min；調(diào)節(jié)pH為8.5，溫度為55 ℃，以每克蛋白質(zhì)3 000單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解3 h；調(diào)節(jié)pH為7.0，溫度為50 ℃，以每克蛋白質(zhì)3 000單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h。升溫至90 ℃，滅酶15 min，以6 000×g離心10 min，取上清液，用截留分子量為2×106U的陶瓷膜過(guò)濾，取中間清液，用截留分子量為1 000 U的超濾膜超濾，得到分子量小于1 000 U的濾過(guò)液，噴霧干燥，得到玉米低聚肽干粉。

1.2.2 玉米低聚肽的基礎(chǔ)理化成分測(cè)定

采用GB/T 5009.5—2016[7]規(guī)定的方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以干基計(jì)，蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25；采用三氯乙酸法[8]測(cè)定酸溶蛋白質(zhì)含量；采用GB/T 5009.6—2016[9]規(guī)定的方法測(cè)定脂肪含量；采用GB/T 5009.4—2016[10]規(guī)定的方法測(cè)定灰分含量；采用GB/T 5009.3—2016[11]規(guī)定的方法測(cè)定水分含量。

1.2.3 總抗氧化能力測(cè)定

使用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法）。ABTS工作母液配制后，室溫避光存放12～16 h后，用PBS稀釋成ABTS工作液。96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入200 μL ABTS工作液。空白對(duì)照孔中加入10 μL蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL各種濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL各種樣品。輕輕混勻。室溫孵育6 min后測(cè)定734 nm下的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。

1.2.4 玉米低聚肽的分離純化

采用RP-HPLC對(duì)玉米低聚肽進(jìn)行分離純化。色譜條件：樣品質(zhì)量濃度，10 mg/mL；流動(dòng)相A，V（水）︰V（三氟乙酸）=100︰0.1；流動(dòng)相B，V（乙腈）︰V（水）︰V（三氟乙酸）=80︰20︰0.1；檢測(cè)波長(zhǎng)，UV 220 nm；流速，0.6 mL/min；柱溫，40℃；進(jìn)樣體積，40 μL。梯度洗脫程序：0～10 min，0～5%流動(dòng)相B；10～25 min，5%～9%流動(dòng)相B；25～35 min，9%～15%流動(dòng)相B；35～55 min，15%～15%流動(dòng)相B；55～100 min，15%～40%流動(dòng)相B；100～120 min，40%～80%流動(dòng)相B。選擇12個(gè)主要的組分峰進(jìn)行收集，通過(guò)氮吹儀除去三氟乙酸、乙腈等有機(jī)溶劑，然后真空冷凍干燥，得到12個(gè)組分峰的干粉備用[12]。

1.2.5 抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

采用Q-TOF 2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定玉米低聚肽的肽段結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜條件：碰撞氣體，Ar；霧化氣體，N2；離子化方式，納升電噴霧正離子；錐孔電壓，50 V；源溫，80 ℃；TOF加速電壓，9.1 kV；毛細(xì)管電壓，800 V；MCP檢測(cè)器電壓，2 150 V；MS和MS/MS的質(zhì)量準(zhǔn)確度，0.1 u。首先對(duì)玉米低聚肽進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到ESI-MS圖。從ESI-MS圖中選出待測(cè)離子，然后進(jìn)行ESI-MS/MS分析，推導(dǎo)出肽段序列。

1.2.6 肽段合成方法

采用多肽固相合成法（Fmoc方法），利用多肽合成儀合成粗肽。然后利用分析型HPLC對(duì)粗肽進(jìn)行檢測(cè)，純度為60%左右。用水將粗肽溶解，利用制備型HPLC進(jìn)行純化，凍干得到純品，再用分析型HPLC進(jìn)行檢測(cè)，純度在98%以上，利用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，保證分子量正確。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel計(jì)算不同指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，所有圖中誤差值采用SD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

結(jié)果顯示，玉米低聚肽中總蛋白質(zhì)含量為92.15%±5.26%（干基），酸溶蛋白質(zhì)含量為87.57%±5.98%，占總蛋白質(zhì)95.03%。脂肪含量為0.06%±0.01%，灰分含量為3.12%±0.38%，水分含量為3.54%±0.29%。玉米低聚肽中蛋白質(zhì)含量很高，占到了90%以上，其中酸溶蛋白質(zhì)所占比例在95%以上，說(shuō)明玉米低聚肽的主要成分是較低分子量的肽類物質(zhì)以及少量的游離氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源。

2.2 玉米低聚肽的總抗氧化能力

目前用于體外測(cè)定物質(zhì)抗氧化能力的方法有很多，但大多數(shù)評(píng)價(jià)的是物質(zhì)清除某一種自由基的能力，不能反映出總抗氧化能力。因此，使用總抗氧化能力來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力更有必要、更全面。ABTS法是國(guó)內(nèi)外普遍用于總抗氧化能力體外測(cè)定的方法，與其他總抗氧化能力測(cè)定方法相比，ABTS法簡(jiǎn)便、快速，與抗氧化物質(zhì)的生物活性相關(guān)性強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米低聚肽的總抗氧化能力為0.48±0.01 mmol/100 g。

2.3 玉米低聚肽的分離純化

目前，分離純化蛋白肽類物質(zhì)的方法主要有高效液相色譜、體積排阻色譜、離子交換層析、大孔吸附樹(shù)脂色譜、凝膠過(guò)濾色譜等。高效液相色譜是廣泛用于分離、分析多肽的一種方法，尤其是反相高效液相色譜（RP-HPLC）已成為研究肽類的主要分離純化手段[13]。玉米低聚肽是由多種肽段組成的小分子肽的混合物，通過(guò)對(duì)玉米低聚肽進(jìn)行分離純化，有助于找到其中發(fā)揮活性的主要組分。玉米低聚肽的分離色譜圖如圖1所示，依據(jù)峰形、峰高、峰面積和分離度四個(gè)指標(biāo)，選擇了12個(gè)主要的組分峰進(jìn)行收集，分別命名為1#～12#。通過(guò)氮吹儀除去三氟乙酸、乙腈等有機(jī)溶劑，再真空冷凍干燥，得到各組分峰的干粉。

圖1 玉米低聚肽的RP-HPLC分離色譜圖

2.4 玉米低聚肽中抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

收集的12個(gè)RP-HPLC組分通過(guò)Q-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。Q-TOF是蛋白測(cè)序的一種新方法，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行測(cè)序，樣品用量少，并且能夠測(cè)定肽段的序列。Q-TOF質(zhì)譜儀采用電噴霧離子源（ESI）和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF），通過(guò)對(duì)各個(gè)組分二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子的質(zhì)譜圖解譜得到肽段的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。從玉米低聚肽的12個(gè)RP-HPLC組分中鑒定出的肽段結(jié)構(gòu)如表1所示。這些肽段都在二肽到七肽之間，肽段序列的分子量均在1 000 U以下。

表1 Q-TOF質(zhì)譜儀鑒定出的玉米低聚肽的肽段結(jié)構(gòu)

將這些肽段合成標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其總抗氧化能力。12個(gè)肽段中，有4個(gè)肽段的總抗氧化能力比玉米低聚肽強(qiáng)，其中YGPQ的總抗氧化能力最強(qiáng)（圖2），為2.64±0.12 mmol/100 g，其次是LSPY、AYPQ和AYLQQQ，分別為2.51±0.19，1.71±0.12和1.70±0.15 mmol/100 g。這4個(gè)抗氧化肽的總抗氧化能力分別是玉米低聚肽的5.5，5.2，3.6和3.5倍。

圖2 玉米低聚肽和四個(gè)肽段的總抗氧化能力

肽段的抗氧化活性與其氨基酸組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系[14]。研究表明，抗氧化活性主要來(lái)源于具有抗氧化性的氨基酸，如Tyr、Arg、Cys、His、Trp[15]。YGPQ、LSPY、AYPQ和AYLQQQ中均含有抗氧化性氨基酸Tyr，這可能是這些肽段具有抗氧化活性的一個(gè)原因。Tyr具有質(zhì)子供體特性，可以通過(guò)供氫能力將氫原子給予自由基，形成的苯氧自由基借助共振而穩(wěn)定，從而使得自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)減慢或終止[16]。其余8個(gè)肽段的總抗氧化能力較弱，但是肽段間的協(xié)同作用也會(huì)對(duì)整體原料肽的活性起到一定的作用[17]。

3 結(jié)論

以玉米黃粉為原料，通過(guò)兩步酶解法制備出玉米低聚肽，其總蛋白質(zhì)含量為92.15%±5.26%，酸溶蛋白質(zhì)含量為87.57%±5.98%，脂肪含量為0.06%±0.01%，灰分含量為3.12%±0.38%，水分含量為3.54%±0.29%。玉米低聚肽的總抗氧化能力為0.48±0.01 mmol/100 g。利用RP-HPLC對(duì)其進(jìn)行分離純化，收集12個(gè)主要的組分峰，利用Q-TOF質(zhì)譜儀測(cè)定肽序列，鑒定出的12個(gè)肽段中，YGPQ、LSPY、AYPQ和AYLQQQ的總抗氧化能力比玉米低聚肽強(qiáng)，分別為2.64±0.12，2.51±0.19，1.71±0.12和1.70±0.15 mmol/100 g。推測(cè)這些肽段中的抗氧化性氨基酸Tyr對(duì)抗氧化活性起到了一定的作用。此次試驗(yàn)明確了玉米低聚肽的抗氧化活性，并對(duì)其含有的抗氧化肽進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，為玉米低聚肽作為抗氧化保健食品的開(kāi)發(fā)利用提供了理論支持。