特殊醫學配方乳粉中硒測定方法探討

鄧陶陶，李清清

1. 國家食品安全風險評估中心（北京 100022）；2. 上海市質量監督檢驗技術研究院，國家食品質量監督檢驗中心（上海）（上海 200233）

硒是一種人體必需的微量元素，具有抗癌、抗衰老、增強人體免疫力、調節人體維生素吸收等作用。硒攝入不足容易引起人體免疫力下降，導致許多疾病的發生，比如近視、白內障、肝癌、肺癌、白血病等。人體的生理活動需要維持一定量的硒，但也不是越多越好，日攝入量達到400 μg也會引起人體代謝功能紊亂，導致頭發脫落、指甲變脆易脫落、神經系統異常等[1-4]。乳粉是嬰幼兒的主要食物，嬰幼兒硒含量缺乏會對其健康產生重大影響，特別是對體質較輕的新生兒影響更大。美國食品和藥物管理局發布硒監管要求中將硒確定為美國嬰兒配方食品中第30種要求強制添加的營養元素。

目前，食品中硒的測定方法主要有原子吸收光譜法[5]、原子熒光光譜法[6]、熒光法[7]、電感耦合等離子體質譜法[8-9]以及電感耦合等離子發射光譜法[10]等。其中，原子熒光光譜法和電感耦合等離子體質譜法為乳粉中較主流的測定方法。試驗以近幾年興起的、研究度關注度較高的特殊醫學配方乳粉為測定對象，對原子熒光光譜法和電感耦合等離子體質譜法測定硒的影響因素進行探討，對測定結果差異性進行分析。

1 材料與設備

Mars 6微波消解儀（美國CEM公司）；iCAP Q電感耦合等離子發射光譜質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Miletone酸純化系統（意大利Miletone公司）；精控電熱爐（上海博通化學科技有限公司）。

硒單元素標準溶液（GSB 04-1751-2004，北京有色金屬研究院）；硝酸（優級純，國藥試劑）；鹽酸（優級純，國藥試劑）；硼氫化鉀（分析純，國藥集團）；氫氧化鉀（分析純，國藥集團）；鐵氰化鉀（分析純，國藥集團）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm，美國Millipore公司）；ICP-MS、調諧溶液（1 μ g/L，Ba、Be、Bi、Ce、Co、In、Li、Ni、Pb、U，美國賽默飛世爾科技公司）。乳蛋白部分水解配方、早產/低出生體重嬰兒配方、無乳糖配方三種特殊醫學配方乳粉（某乳粉公司提供）；質控乳粉（乳粉企業質控樣品，某乳粉公司提供）。

2 試驗方法

2.1 原子熒光光譜法

2.1.1 樣品前處理

特殊醫學配方乳粉經搖勻后，稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）置于微波消解管中，加入5 mL經純化的硝酸，放在電爐上100 ℃預熱40 min，后放入微波消解儀，按照微波升溫程序進行消解，冷卻取出，置于電熱爐上170 ℃將酸液揮發至近干（不可蒸干），加5 mL 6 mol/L鹽酸溶液，繼續加熱至酸液揮發至0.5 mL左右，冷卻，轉移至10 mL容量瓶中，加入2.5 mL鐵氰化鉀溶液（100 g/L），用水定容，上機檢測。同時做試劑空白試驗。微波升溫程序見表1。

表1 微波消解升溫程序

2.1.2 儀器測試條件

原子熒光光譜儀參數設置：燈電壓300 V，燈電流22 mA，原子化器高度8 mm，載氣流速600 mL/min，屏蔽氣流速1 000 mL/min。讀數方式：峰面積，延遲時間1 s，讀數時間15 s。

載流：5%鹽酸；還原劑：20 g/L硼氫化鉀（用5 g/L氫氧化鉀溶液定容）。

標準溶液梯度質量濃度：4，8，12，16和20 μ g/L。

2.1.3 樣品測定和加標試驗

對乳蛋白部分水解配方、早產/低出生體重嬰兒配方、無乳糖配方3種特殊醫學配方乳粉及質控乳粉（硒含量范圍17.11～23.23 μg/100 g，中位值20.17 μg/100 g）進行測定，每個樣品重復6個平行樣。以6次平行測定結果的平均值為參考，分別對3種特殊醫學乳粉進行等量加標，每個加標做2個平行樣品。

2.2 電感耦合等離子體質譜法

2.2.1 樣品前處理

特殊醫學配方乳粉經搖勻后，稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）置于微波消解管中，加入5 mL經純化的硝酸，放在電爐上100 ℃預熱40 min，再放入按照微波升溫程序進行消解，后冷卻取出，置于電熱爐上180℃將酸液揮發至0.5 mL左右，冷卻后用純水定容至10 mL，上機檢測。微波升溫程序同2.1.1。

2.2.2 儀器測試條件

載氣，高純氬氣；等離子體氣流量，14.0 L/min；載氣流速，0.80 L/min；輔助氣，1.00 L/min；采樣深度，5.0 mm；入射功率，1 550 W；檢測質量數，m/z 78（Se）。

標準溶液梯度質量濃度：5，10，15，20和25 μ g/L。

2.2.3 樣品測定和基質加標測試

對乳蛋白部分水解配方、早產/低出生體重嬰兒配方、無乳糖配方3種特殊醫學配方乳粉及質控乳粉（硒含量范圍17.11～23.23 μg/100 g，中位值20.17 μg/100 g）進行測定，每個樣品重復6個平行樣。以6次平行測定結果的平均值為參考，分別對3種特殊醫學乳粉進行等量加標，每個加標做2個平行樣品。

3 結果與討論

3.1 試驗結果

3.1.1 原子熒光光譜法測定結果

三種特殊醫學配方乳粉及質控乳粉測定結果見表2，三種特殊醫學配方乳粉加標測定結果見表3。

表2 原子熒光光譜法特殊醫學配方乳粉及質控乳粉測定結果

表3 原子熒光光譜法特殊醫學配方乳粉加標回收結果

3.1.2 電感耦合等離子體質譜法測定結果

三種特殊醫學配方乳粉及質控乳粉測定結果見表4。三種特殊醫學配方乳粉加標測定結果見表5。

表4 電感耦合等離子體質譜法特殊醫學配方乳粉及質控乳粉測定結果

表5 電感耦合等離子體質譜法特殊醫學配方乳粉加標回收結果

3.2 討論

3.2.1 原子熒光光譜法測定的影響因素

3.2.1.1 微波消解條件的影響

試驗分別考察了185 ℃/15 min，190 ℃/20 min，195 ℃/25 min，200 ℃/15 min和200 ℃/25 min五種不同消解條件對結果的影響。結果見圖1。

由圖1可知，隨著消解條件的增強，測定的結果顯著升高。分析原因：原子熒光光譜法的測定原理是先將硒還原成六價態硒，然后氫化形成氫化硒進入儀器檢測。如果消解條件偏弱，有些硒形態鍵不能完全打開，進而不能被還原成六價態，影響氫化硒的形成而使測定結果偏低；隨著消解條件的增強，樣品被消化得更完全，硒更容易形成氫化物而被檢測，從而使檢測結果升高。

圖1 微波消解條件對原子熒光光譜法測定結果的影響

在選擇消解條件時，一方面要考慮測定結果的準確性，另一方面要考慮試驗效率和微波消解儀的損耗，綜合考慮選擇195 ℃/25 min為消解條件。

3.2.1.2 鹽酸加入時機的影響

試驗分別考察了在趕酸初期、中期和酸近干時加入2 mL鹽酸對測定結果的影響。結果表明，在酸近干時加入鹽酸，質控樣最接近中位值，而在初期和中期加入鹽酸，測定結果均偏低。分析原因：鹽酸是將硒還原成六價態硒的關鍵試劑，而硝酸具有氧化性，如果在硝酸存在量較大時加入鹽酸，會影響鹽酸對硒的還原效果，進而影響硒氫化物形成而使結果偏低。

3.2.1.3 鐵氰化鉀的影響

試驗分別考察了加入鐵氰化鉀和不加入鐵氰化鉀對結果的影響。結果表明，鐵氰化鉀的加入對熒光響應值無明顯影響，加入鐵氰化鉀和不加入鐵氰化鉀的標準溶液熒光讀數值基本一致；加入鐵氰化鉀的樣品溶液讀數更加穩定，多次讀數的標準偏差更低，樣品的平行性更好。因此加入鐵氰化鉀可以幫助穩定原子熒光響應值，使測定結果重復性更好。

3.2.1.4 還原劑濃度的影響

試驗分別考察了10，15，20和25 g/L硼氫化鉀對測定結果的影響。結果見圖2。隨著硼氫化鉀濃度的提高，測定結果也隨之增高。分析原因：硼氫化鉀是硒形成氫化物的關鍵試劑。硼氫化鉀濃度偏低，會影響硒氫化物的生成效率，使結果偏低；隨著濃度的升高，硒被氫化得更完全，從而測定結果升高。考慮結果的準確性和試劑的消耗性，使用20 g/L硼氫化鉀為還原劑。

圖2 硼氫化鉀濃度對原子熒光光譜法測定結果的影響

3.2.2 電感耦合等離子體質譜法的影響因素

3.2.2.1 質量數選擇

硒有不同的同位素，其中豐度比最大的80Se（天然豐度比為49.8%）由于受氬的二聚物（Ar2，m/z 80）嚴重干擾，不能用于質譜檢測。其他同位素有77Se（天然豐度比為7.6%）、78Se（天然豐度比為23.7%）、82Se（天然豐度比為9.2%），但這幾個同位素也受到40Ar37Cl、40Ca37Cl、39K38Ar、42Ca40Ar、81BH等多原子離子的干擾，綜合比較質譜干擾因素和響應值等方面的影響，選擇78Se為檢測質量數。

3.2.2.2 質譜檢條件的影響

試驗比較了0.5，1.0和2.0 L/min的碰撞氣對測定效果的影響。由于硒受多原子離子的干擾比較嚴重，所以不能用標準模式進行檢測，要采用氦氣碰撞模式在一定程度上消除干擾。由于選擇的質量數是豐度比較小質量數，其質譜響應較低，如果選擇過大流量的碰撞氣，則會使靈敏度過低，導致穩定性、重現性變差，而碰撞氣流量過小、消除干擾能力弱，又會使結果偏大失真。綜合考慮靈敏度和穩定性等方面的影響，選擇1.0 L/min作為碰撞氣流量。

3.2.2.3 消解條件的影響

圖3 微波消解條件對電感耦合等離子體質譜法測定結果的影響

分別考察了185 ℃/15min，190 ℃/20 min，195℃/25 min，200 ℃/15 min和200 ℃/25 min五種不同消解條件對結果的影響，結果見圖3。隨著消解條件的增強，測定結果稍有降低。分析原因：等離子體質譜測定時會受碳鏈增益效應的影響，當消解條件較弱時，樣品溶液中碳鏈消除不徹底，會在一定程度上對信號產生增益，而使測定結果偏高。

3.2.3 兩種測定方法的差異

由結果可看出，電耦合等離子體質譜法的測定結果較原子熒光光譜法的測定結果高10%左右。分析原因：（1）電感耦合等離子體質譜法的質譜干擾和碳鏈增益效應，由于硒的幾個同位素質量數受氬氣的干擾很大，氬氣又是質譜檢測的主要氣體，其多原子離子干擾只能通過碰撞模式在一定程度上減弱，而達不到徹底消除的效果；再則，乳粉中的有機物含量很大，在消解過程中如果不能將碳鏈完全消除，會對質譜檢測產生一定的碳鏈增益干擾，這種碳干擾已在近年的質譜研究中被多次報道[11-14]，同時也由于選擇的不是主豐度比的質量數，其信號值偏低，這種增益效應對結果產生的影響就相對更加明顯；（2）原子熒光光譜法受硒的還原反應和氫化反應的影響，而這些反應在一定程度上受硝酸的氧化效應和氫氣的氫化效率的制約，同時配方乳粉中硒形態除了外源添加的硒（一般為亞硒酸鈉）外，還有硒蛋白、硒氨基酸等復雜生物形態[15]，這些硒如在前處理過程中不能完全被釋放出來，則會影響其形成氫化物，從而在一定程度上使結果偏低。

電耦合等離子體質譜法的優點在于樣品消化后，可以直接進行上機操作，不需要進行其他反應處理，操作簡便，檢測速度快；但缺點在于硒的幾個同位素質量數都不同程度地受到氬的二聚物及多原子離子干擾，使檢測結果偏高，同時由于乳粉中的有機物含量較大而產生的碳增益效應，也對結果產生正干擾。

原子熒光光譜法的優點在于其檢測原理是利用硒的熒光響應值作為檢測信號，檢測的特異性強，干擾較少；而缺點在于樣品在消化之后要進行多步還原和氫化反應，操作較為繁瑣，同時樣品中硒的形態釋放程度和還原反應效率等因素，都會對結果產生負面影響。

4 結論

試驗分別用原子熒光光譜法和電感耦合等離子體質譜法對特殊醫學配方乳粉中硒進行測定，考察了微波消解條件、還原反應條件、氫化反應條件、質譜條件等因素對結果的影響，比較了兩種檢測方法的差異。結果表明，電耦合等離子體質譜法的測定結果普遍高于原子熒光光譜法的測定結果，其質譜影響因素主要在于質譜多原子離子干擾和碳增益效應，而原子熒光光譜法主要受硒的形態釋放程度和還原反應效率制約。