姜黃素碳酸鈣微球的制備及其載藥性能

宋娟，張華山，魯江，盧薇

湖北工業(yè)大學(xué)分析測試中心（武漢 430068）

姜黃素（Curumin，Cur）是從中藥姜黃、郁金、莪術(shù)等植物塊莖中提取出來的天然活性物質(zhì)。研究表明，姜黃素具有多方面的藥理作用，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗纖維化等，具有非常大的開發(fā)應(yīng)用前景[1-6]。但由于姜黃素的水溶性差、易氧化、體內(nèi)吸收差和生物利用度低等諸多缺陷，目前其在臨床上運用十分有限[7-8]。近年來大量研究致力于克服這些缺陷，將藥物制成膠束，從而提高溶解度和穩(wěn)定性[9]；制成高分子共聚物從而改善其溶解度和緩釋性[10]；微球[11]和微乳[12]能夠改善穩(wěn)定性、緩釋性及生物利用度。

目前，在CaCO3藥物載體研究領(lǐng)域主要通過仿生合成的方法制備具有良好生物學(xué)性能的CaCO3礦化產(chǎn)物。CaCO3作為藥物控緩釋載體，與聚合物載體相比，具有很多優(yōu)點。CaCO3的制備處理過程相對簡單，并且對環(huán)境無污染，還具有生物相容性和生物可降解性，對人體無毒副作用，易于排出體外，上述優(yōu)點使得CaCO3成為較為理想的藥物載體[13-15]。蛋黃卵磷脂（Egg yolk lecithin，EYL）作為磷脂的較好來源之一，其主要成分為磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC）和神經(jīng)鞘磷脂（Sphingomyelin，SM），其中PC含量70%～80%，SM含量15%～20%。磷脂分子的極性頭部含有一個帶負(fù)電的磷脂酰基基團及一個帶正電的季銨基團，即其有一個非極性的疏水端和一個極性的親水端。卵磷脂分子的極性頭部對鈣離子有特異的結(jié)合作用，具有局部富集鈣離子的作用，而這種特異性的結(jié)合作用可以促進碳酸鈣團聚態(tài)微球的形成。EYL和CaCO3兩者均具有良好的生物相容性，可降解性和無毒等特點。試驗選取Cur作為模型藥物，以EYL為制備模板調(diào)控得到的CaCO3復(fù)合微球作為藥物載體，采用溶劑法制備姜黃素碳酸鈣微球，考察其體外溶出變化，并通過物相表征探索其提高溶出速率的機制，為EYL為制備模板調(diào)控得到的CaCO3微球作為藥物載體提供理論和實踐依據(jù)，以期提高難溶性藥物的溶出度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素、蛋黃卵磷脂（分析純，美國Sigma公司）；試驗用水（Milli-Q超純水）；其他試劑均為分析純。

掃描電鏡（JSM-6390 LV型，日本電子公司）；透射電鏡（JEM-2100型，日本電子公司）；熱重分析儀（TGA/DSC-1 Star system，瑞士Mettler Toledo公司）；紫外分光光度計（UV-2410 PC，日本Shimadzu公司）。

1.2 CaCO3微球的制備

據(jù)前期試驗結(jié)果[16]，將250 mg EYL在超聲下溶脹于10 mL 0.3 mol/L CaCl2溶液中，制備EYL的CaCl2溶液。將此混合液與0.3 mol/L Na2CO3溶液在攪拌下快速混合，沉淀迅速產(chǎn)生。待沉淀靜置陳化2 h之后，將沉淀清洗離心并用乙醇淋洗幾次，自然干燥后待測。由于每個樣品的陳化時間相同，可認(rèn)為陳化作用對樣品的形貌不會產(chǎn)生影響，或可能由于陳化作用而造成的形貌差異可以被消除。空白試驗與上述試驗條件相同，將不含EYL的10 mL 0.3 mol/L的CaCl2溶液與10 mL 0.3 mol/L的Na2CO3溶液在攪拌下快速混合，沉淀同樣陳化30 min后離心清洗、干燥后待用。

1.3 姜黃素碳酸鈣微球的制備

按照Cur與CaCO3質(zhì)量比為1︰1，1︰2和1︰4，分別制備不同比例的姜黃素碳酸鈣微球，精密稱取100 mg Cur溶于100 mL 80%乙醇溶液中，按照不同的質(zhì)量比加入適量CaCO3粉末，水浴超聲至載體完全分散，室溫下繼續(xù)磁力攪拌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，得到均一的黃色固體，真空干燥，研磨，過80目篩，得到姜黃素碳酸鈣微球。

1.4 載體和微球結(jié)構(gòu)、形貌及性質(zhì)的表征

1.4.1 透射電鏡分析（TEM）

TEM用于分析制得的CaCO3樣品精細結(jié)構(gòu)，將研磨后的樣品分散于乙醇溶液中，超聲分散后，銅微柵撈起，樣品附于柵網(wǎng)上，晾干備用。工作條件為100 kV。

1.4.2 掃描電鏡分析（SEM）

SEM用于觀察將原料藥、CaCO3、物理混合物和姜黃素碳酸鈣微球的粉末樣品表面形貌分析，將樣品分別置于離子濺射儀中，噴鍍約20 nm鉑金膜。工作條件為：高壓30 kV，束流5×10-9mA，工作距離10 mm。

1.4.3 差示量熱掃描分析（DSC）

分別對Cur、CaCO3、物理混合物和姜黃素碳酸鈣微球進行DSC分析。掃描范圍25～250 ℃，升溫速率10.00 ℃/min。

1.5 體外溶出度測定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.5.1.1 線性關(guān)系考察

精密稱取Cur 5.0 mg，加入無水乙醇10 mL溶解，得到500 mg/L的對照品儲備液。精密量取適量儲備液，分別置于10 mL量瓶中，用0.2% SDS溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，6.00和8.00 mg/L工作液。對照儲備液用溶解介質(zhì)稀釋后，運用紫外分光光度計在200～600 nm波長掃描，Cur的最大吸收波長430 nm，選擇430 nm為檢測波長。利用紫外分光光度計測定各質(zhì)量濃度樣品在430 nm檢測波長下的吸光度（A）。以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.1.2 精密度試驗

精確配制姜黃素高、中、低（0.4，2.0和6.0 mg/L）3種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1 d之內(nèi)分別測定5次，計算日內(nèi)誤差；同法每日測定1次，連續(xù)測定5 d，計算日間誤差。

1.5.1.3 穩(wěn)定性試驗

取2.0 mg/L姜黃素對照品，分別于0，2，4，6，8和12 h測定吸收度。

1.5.1.4 重現(xiàn)性試驗

分別取對照品溶液加溶出介質(zhì)稀釋成含姜黃素0.4，2.0和6.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液，在430 nm處測定吸光度，重復(fù)測定5次。

1.5.2 溶出度測定

按照《中國藥典》2015年版溶出度測定法第二法（槳法）測定[17]。溶出介質(zhì)900 mL，轉(zhuǎn)速100 r/min，水浴溫度37.0±0.5 ℃。將Cur及各種比例的姜黃素碳酸鈣微球（均含10 mg Cur），分別分散至介質(zhì)中，分別于5，10，20，30，45，60，90和120 min取樣5 mL，并即時補充5 mL溶出介質(zhì)，樣品以15 000 r/min離心3 min，取上清液于430 nm檢測波長下測定A。將A值帶入回歸方程計算藥物積累溶出度。每個樣品平行試驗6次，計算平均值，繪制溶出曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 載體和微球的結(jié)構(gòu)、形貌及性質(zhì)的表征

2.1.1 透射電鏡分析（TEM）

為進一步了解CaCO3中納米結(jié)構(gòu)，采用高分辨透射電鏡對其進行分析，結(jié)果見圖1。圖1（A）所示，球狀顆粒的納米團聚結(jié)構(gòu)明顯，這些納米顆粒的直徑在幾十個納米左右，顆粒之間相互搭建，形成較為松散的多孔結(jié)構(gòu)。晶格像（圖1B）說明一個納米顆粒中還存在取向各異的亞晶結(jié)構(gòu)，大小約幾個納米。EYL作為有機模板對CaCO3的成核與生長具有明顯的調(diào)制作用。

圖1 CaCO3的高分辨透射電鏡圖（A）和局部放大高分辨像（B）

2.1.2 掃描電鏡分析（SEM）

對原料藥、CaCO3、物理混合物和姜黃素碳酸鈣微球分別進行表面形貌分析，結(jié)果見圖2。SEM下可見Cur呈現(xiàn)明顯晶體顆粒狀（圖2A），CaCO3則外觀呈球狀，大小均一，分散性好的球型顆粒，粒徑在5 μ m左右（圖2B），Cur和CaCO3物理混合樣品的微球和晶體摻雜在一起（圖2C），而姜黃素碳酸鈣微球不同于物理混合樣品，未見明顯晶體顆粒（圖2D），說明Cur很好地分散到碳酸鈣微球中。

圖2 Cur原料藥（A）、CaCO3（B）、物理混合物（C）、姜黃素碳酸鈣微球（D）的掃描電鏡圖

2.1.3 差示量熱掃描分析（DSC）

DSC分析結(jié)果如圖3所示。Cur原藥在183 ℃處有明顯的吸收峰，對應(yīng)Cur的熔點，CaCO3在25～250 ℃未出現(xiàn)吸熱峰，物理混合物中仍可見Cur的吸收峰，表明該混合物是原料藥和載體的簡單混合，而姜黃素碳酸鈣微球中藥物吸熱峰消失，提示藥物成功加載于微球。

圖3 Cur原料藥（A）、CaCO3（B）、物理混合物（C）和姜黃素碳酸鈣微球（D）的差示掃描量熱圖

2.2 體外溶出度測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將吸光度（A）和質(zhì)量濃度進行回歸，得到回歸方程A=1.269X+0.054，r=0.999 9，可知Cur在0.25～8 mg/L質(zhì)量濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。姜黃素低、中、高濃度重復(fù)測定5次，其日內(nèi)精密度RSD為0.308%，0.112%和0.171%，日間精密度RSD為0.366%，0.426%和0.659%，結(jié)果顯示該方法精密度良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，在不同的時間點測定姜黃素吸收度RSD為0.145%，表明樣品在12 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。姜黃素低、中、高濃度測定5次，其吸收度RSD分別為0.149%，0.050%和0.084%，表明該方法測定結(jié)果重現(xiàn)性良好。

2.2.2 溶出度測定

溶出度結(jié)果見圖4。姜黃素碳酸鈣微球的溶出速率明顯高于Cur原藥，并且隨著CaCO3比例增加，姜黃素碳酸鈣微球的溶出速率明顯增加，以Cur-CaCO31︰4時制備的姜黃素碳酸鈣微球溶出效果最佳，120 min累計溶出率可達78%。

圖4 姜黃素及姜黃素碳酸鈣微球樣品釋放曲線

3 結(jié)論

CaCO3作為藥物載體，與其他聚合物載體相比，具有明顯優(yōu)勢：制備過程簡單且對環(huán)境無污染；同時具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，對人體無害并能排出體外；pH敏感性使其可以通過癌細胞內(nèi)部溶酶體或在癌細胞外部的弱酸性環(huán)境下觸發(fā)藥物釋放[18]。近年來，隨著仿生礦化研究的不斷發(fā)展，CaCO3作為藥物載體研究取得諸多成果，主要集中在利用直接載藥[18]，利用CaCO3作為犧牲模板的載藥微囊[19]，CaCO3載體表面加載靶向配體[20]。試驗創(chuàng)新性地采用CaCO3作為藥物載體，加載疏水性藥物Cur，提高Cur的生物利用度，為CaCO3在中藥及有效成分的研究提供創(chuàng)新性思路。

EYL與Ca2+之間存在著特異性的相互作用，表面帶負(fù)電的EYL可以在溶液中有效地吸附、富集Ca2+，從而在表面形成有利于大量成核位點形成的局部過飽和區(qū)，并進一步導(dǎo)致CaCO3納米粒子的生長。這些納米粒子隨后團聚成多孔的球形顆粒。在EYL為有機模板的調(diào)控下，誘導(dǎo)出由納米粒子團聚而成的具有多級構(gòu)造的多孔CaCO3球形顆粒。試驗通過制備姜黃素碳酸鈣微球，將Cur負(fù)載于松散多孔結(jié)構(gòu)的CaCO3內(nèi)，顯著增加了Cur的有效溶出面積。故以EYL調(diào)控得到的CaCO3為載體，可顯著提高難溶性藥物的溶出速率和溶出度，為后期提高水難溶性的藥物的生物利用度提供新的思路，并為進一步試驗研究奠定基礎(chǔ)。