銀杏葡萄酒自由基清除能力及其與總酚含量的關系

馮濤，趙宇，桑敏，王旭增，張鈺*

1. 上海應用技術大學香料香精技術與工程學院（上海 201418）；2. 上海應用技術大學技術轉(zhuǎn)移中心（上海 200235）

銀杏（Gingko，Gingko biloba L.）主要種植于在溫帶、亞熱帶地區(qū)，是世界上最古老的樹種之一，并且在我國資源豐富，占世界總資源的70%以上[1]。近年來，關于銀杏葉提取物的藥用價值和保健價值得到各行各業(yè)的廣泛關注。然而，目前對于銀杏種仁的研究較少，銀杏果的深加工還處在初始階段，造成銀杏果經(jīng)濟效益不樂觀。作為一種傳統(tǒng)食品和藥品的來源，銀杏種仁早在五千年前就被用于添加到甜點、飲料和酒當中，并且作為中國傳統(tǒng)藥材也被記錄在《本草綱目》當中[2]。銀杏果實中富含淀粉、維生素、蛋白質(zhì)以及多種氨基酸；成熟的果實中還含有多種N、K等常量元素以及Zn、Fe等微量元素[3]。除此之外，果實中含有豐富的黃酮類、酚類及內(nèi)酯類等生物活性成分，能夠降血脂、促進血液循環(huán)、止咳平喘及清除自由基，具有極高的藥用價值及保健價值[4-5]。

目前銀杏在釀酒行業(yè)的應用主要體現(xiàn)在銀杏葉提取物參與酒精發(fā)酵以及銀杏果釀造白酒上[6-7]，對于銀杏果應用于葡萄酒行業(yè)的還未見報道。因此以葡萄酒為依托，開發(fā)一種新型葡萄酒，既可以豐富葡萄酒的種類，又可以延長銀杏產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，提高其經(jīng)濟附加值。

氧自由基與衰老、癌癥、心腦血管疾病和炎癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關，因此清除自由基的能力是評價抗氧化能力大小的一個重要指標[8-9]。流行病學研究表明，適量飲用葡萄酒對于人體健康具有很大的益處[10-11]，還可以增加血清抗氧化能力，這是由于葡萄酒中含有豐富的酚類化合物，具有預防冠心病、減少癌癥發(fā)病率和慢性疾病的作用[12-13]。此外，有研究表明，銀杏果中含有豐富的銀杏多糖、銀杏蛋白以及黃酮類、酚類、萜類、內(nèi)酯類化合物，具有清除自由基活性以及預防心血管疾病的能力[14]。流行病學研究建議適當食用某些具有抗氧化生物活性的植物材料（比如銀杏、葡萄等）可減少氧化應激相關慢性疾病的發(fā)生風險，從而加強身體健康[15-16]。

為此，試驗以葡萄酒為依托釀造銀杏葡萄酒，開發(fā)出一種新型保健酒。新產(chǎn)品不但具有較好的營養(yǎng)保健作用，而且風味口感協(xié)調(diào)，為銀杏葡萄酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論與試驗依據(jù)，并對其總酚含量以及抗氧化活性進行測定，同時研究總酚含量與抗氧化活性之間的相關性，為消費者選擇有益于身體健康的葡萄酒提供有力參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄（Vitis L.），上海市奉賢區(qū)海灣鎮(zhèn)葡萄種植園；銀杏（Gingko biloba L.），市售；釀酒酵母，安琪酵母有限公司。

福林-肖卡（Folin-Ciocalteau，F(xiàn)C）試劑；DPPH（1, 1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）、ABTS [2, 2’-Azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）]、Trolox，美國Sigma-Aldrich公司；沒食子酸、槲皮素、阿魏酸、咖啡酸、香豆酸、兒茶素、表兒茶素（均為色譜純）、乙腈（色譜純）、沒食子酸、碳酸鈉、過硫酸鉀、無水乙醇，均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2350紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；QL-901漩渦混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；1260 Indinity高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 銀杏葡萄酒釀造工藝流程

1.3.2 主要理化指標的測定

酒精度、總糖、總酸、揮發(fā)酸、游離二氧化硫含量的測定方法參照GB/T 15038—2006[17]。

1.3.3 自由基清除活性的測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除活性參考Miti?等[18]的方法，稍作修改后進行測定。吸取0.1 mL 10倍稀釋后的酒樣，加到3.9 mL 25 mg/L的DPPH/乙醇溶液中，漩渦混合均勻，避光條件下反應20 min后，于515 nm處測定反應液吸光度。每個樣品做3次平行試驗。以15%的乙醇溶液代替酒樣作為對照。DPPH自由基清除能力根據(jù)Trolox標準曲線以TEAC當量（Tro1ox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除活性

ABTS+自由基清除活性參考Wang等[19]的方法，稍作修改后進行測定。吸取0.1 mL 10倍稀釋后的酒樣，加到3.9 mL ABTS+工作溶液[2.45 mmol/L K2(SO4)2溶液與7 mmol/L ABTS溶液等體積混合，黑暗中反應12～16 h；稀釋至在734 nm處吸光度為0.7±0.02]中，漩渦混合均勻，避光條件下反應8 min后，于734 nm處測定反應液吸光度。每個樣品做3次平行試驗。以15%的乙醇溶液代替酒樣作為對照。ABTS+自由基清除能力根據(jù)Trolox標準曲線以TEAC當量（Tro1ox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示。

1.3.4 總酚含量的測定

總酚含量的測定參考Wang等[19]的方法，稍作修改后進行測定。吸取1 mL 10倍稀釋后的酒樣，加入5 mL去離子水，漩渦混合均勻，加入0.1 mL 1 mol/L的FC試劑，混合均勻；1 min后加入3 mL質(zhì)量分數(shù)為7.5%的Na2CO3溶液，最后加入0.9 mL去離子水，漩渦振蕩混合均勻后，于75 ℃恒溫振蕩水槽中水浴加熱反應10 min。于765 nm處測定反應液吸光度。每個樣品做3次平行試驗。以15%的乙醇溶液代替酒樣作為對照。總酚含量結(jié)果根據(jù)沒食子酸標準曲線以GAE當量（Gallic acid equivalent，沒食子酸當量）表示。

1.3.5 HPLC-DAD測定單體酚組成

色譜條件：參考Miti?等[18]的方法，稍作修改。

色譜柱：Agilent HC-C18柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；柱溫，30 ℃；進樣量，10 μL；檢測波長，320 nm；流速，0.8 mL/min。

流動相A，1%磷酸水溶液；流動相B，乙腈。洗脫程序：0～2 min，流動相A 90%～70%，2～8 min，流動相A 70%～35%，8～14 min，流動相A 35%～5%，14～18 min，流動相A 5%～35%，18～20 min，流動相A 35%～90%，20～22 min，流動相A/流動相B為90︰10。

標準溶液的制備：配制質(zhì)量濃度均為120 mg/L的沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、槲皮素混合標準溶液，并稀釋成不同的濃度梯度。

酒樣單體酚測定：參考?eruga等[20]的方法，稍作修改。樣品測定前用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗結(jié)果表示為平均值±標準偏差（SD）。采用SPSS 19.0（IBM，Armonk，NY，USA）軟件進行酒樣自由基清除活性與總酚含量的相關性分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要理化指標

銀杏葡萄酒的主要理化指標測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，銀杏葡萄酒和對照葡萄酒的酒精度、總糖、總酸、揮發(fā)酸和游離二氧化硫等指標均符合葡萄酒國家標準GB 15038—2006。

表1 理化指標分析結(jié)果

2.2 自由基清除活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性

Trolox標準曲線的標準方程為y=0.685 1-0.000 587 5x，標準曲線的相關系數(shù)R2=0.996 1，表明曲線具有較好的相關性。

銀杏葡萄酒的DPPH自由基清除能力見圖1。對照葡萄酒DPPH自由基清除能力相當于694.39 μmol/L Trolox當量，而銀杏酶解液的加入對葡萄酒的DPPH自由基清除能力有明顯的提高作用。其中，當酶解液添加量為20%時，提高得最多（提高263.51 μmol/L），其DPPH自由基清除能力相當于957.9 μmol/L Trolox當量。而當酶解液添加量為30%時，其DPPH自由基清除能力相當于922.16 μmol/L Trolox當量，相對于對照組提高了227.77 μmol/L，僅次于20%添加量的銀杏葡萄酒。

根據(jù)該試驗結(jié)果，認為銀杏酶解液的加入能提高葡萄酒DPPH自由基清除能力，從而具有較好的抗氧化、延緩衰老的作用。具有較好抗氧化效果的是銀杏酶解液添加量為20%的銀杏葡萄酒。

圖1 銀杏葡萄酒的DPPH自由基清除能力（以TEAC當量表示）

2.2.2 ABTS+自由基清除活性

Trolox標準曲線的標準方程為y=0.688 3-0.000 658 2x，標準曲線的相關系數(shù)R2=0.998 4，表明曲線具有較好的相關性。

銀杏葡萄酒的ABTS+自由基清除能力見圖2。對照葡萄酒ABTS+自由基清除能力相當于724.20 μmol/L Trolox當量，而銀杏酶解液的加入對葡萄酒的ABTS+自由基清除能力有提高作用。其中，當酶解液添加量為20%和30%時，提高得最多，其ABTS+自由基清除能力分別相當于844.79和857.39 μmol/L Trolox當量。其次，其他添加量的銀杏葡萄酒ABTS+自由基清除能力相對于對照葡萄酒均有不同程度的提高。

根據(jù)試驗結(jié)果，認為銀杏酶解液的加入能在不同程度上提高葡萄酒ABTS+自由基清除能力，從而具有較高的抗氧化活性。因此，具有較好抗氧化效果的是銀杏酶解液添加量為20%和30%的銀杏葡萄酒。

圖2 銀杏葡萄酒的ABTS自由基清除能力（以TEAC當量表示）

2.3 總酚含量

沒食子酸標準曲線的標準方程為y=0.000 959 5x-0.003 55，標準曲線的相關系數(shù)R2=0.999 8，表明曲線具有較好的相關性。

銀杏葡萄酒的總酚含量見圖3。對照葡萄酒的總酚含量為1 193.71 mg/L，而銀杏酶解液的加入對葡萄酒的總酚含量具有增加的作用。銀杏葡萄酒的總酚含量變化范圍為1 327.46～2 130.71 mg/L，其中，當酶解液添加量為20%時，葡萄酒總酚含量提高了937 mg/L，總酚含量達到2 130.71 mg/L。銀杏葡萄酒的總酚含量由大到小依次為：20%添加量＞30%添加量＞40%添加量＞10%添加量＞50%添加量。

根據(jù)試驗結(jié)果，認為銀杏酶解液的加入能在不同程度上提高葡萄酒的總酚含量，且具有高總酚含量的是銀杏酶解液添加量為20%的銀杏葡萄酒。

圖3 銀杏葡萄酒的總酚含量（以GAE當量表示）

2.4 單體酚測定

以峰面積為橫坐標x，標準溶液的濃度為縱坐標y，得到每個單體酚的回歸方程，結(jié)果見表2。沒食子酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸和槲皮素5種單體酚標準品的質(zhì)量濃度與相應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

表2 多酚物質(zhì)保留時間和回歸方程

根據(jù)前述色譜條件檢測對照組葡萄酒和銀杏葡萄酒中5種單體酚含量，結(jié)果見表3。由表3可知，在對照組葡萄酒和銀杏葡萄酒中均檢測到了上述5種單體酚，且沒食子酸含量最高。隨著銀杏酶解液添加量的增加，5種單體酚的含量均呈現(xiàn)減少的趨勢，這是由于銀杏果中含有的酚類物質(zhì)主要是烷基酚類化合物，包括白果酚、白果二酚等，而上述5種單體酚的含量較少。因此，隨著銀杏酶解液的添加量的增加，沒食子酸等5種單體酚的含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。

表3 葡萄酒中單體酚含量的測定 mg/L

2.5 總酚含量與自由基清除活性的相關性分析

試驗結(jié)果表明，銀杏葡萄酒的DPPH、ABTS自由基清除活性與總酚含量的變化趨勢具有一定的一致性。由圖4可知，總酚含量與自由基清除活性呈現(xiàn)出一定的相關性，擬合線性回歸方程分別為y=0.262 6x+406.965 1和y=0.134 6x+571.375 9，且皮爾遜相關性系數(shù)分別為0.72和0.74。由此說明銀杏葡萄酒的總酚含量與自由基清除能力具有較好的相關性，且酚類化合物是抗氧化活性的主要貢獻者，當酚類化合物的羥基數(shù)目增多，其抗氧化活性就越強[21]。

Linda等[22]研究了巴西蜂蜜及其提取物酚類物質(zhì)以及抗氧化活性。結(jié)果表明：酚類物質(zhì)是影響蜂蜜抗氧化活性的主要組分，表明其總酚含量和抗氧化活性可以用來評估蜂蜜的品質(zhì)。Burns等[23]研究了紅葡萄酒抗氧化活性與總酚含量之間的關系。結(jié)果表明：總酚含量越高，其抗氧化活性越強，表明不同多酚含量的葡萄酒可以產(chǎn)生不同程度的抗氧化活性，紅葡萄酒可以為消費者提供更多對于健康有益的可能性。除此之外，許多學者研究表明：抗氧化活性與總酚含量之間具有不同程度的相關性[24-25]。

圖4 總酚含量與抗氧化活性的相關性

3 討論與結(jié)論

多酚類物質(zhì)是葡萄、葡萄酒等物質(zhì)中含有的一類主要的抗氧化活性成分，而其起到抗氧化活性的成分主要來源于黃酮類以及酚酸類物質(zhì)[26]。目前大量研究表明：膳食攝入適量的植物生物活性物質(zhì)與降低心血管疾病的風險之間具有強有力的聯(lián)系。尤其是膳食攝入黃酮及酚類物質(zhì)對于冠狀動脈疾病和心肌梗死的發(fā)病率之間呈現(xiàn)一定的相關性[27]。試驗采用DPPH、ABTS自由基清除能力探討銀杏葡萄酒的抗氧化活性。結(jié)果表明：銀杏葡萄酒的總酚含量變化范圍介于1 588.76～2 130.71 mg/L之間，平均含量為1 693.68 mg/L。銀杏葡萄酒總酚含量與DPPH自由基清除能力相關性較好（R2=0.72，p=0.02），與此同時銀杏葡萄酒總酚含量與ABTS自由基清除能力相關性較好（R2=0.74，p=0.01），表明銀杏葡萄酒中多酚類物質(zhì)與其抗氧化活性之間的關系密切，說明酚類物質(zhì)是銀杏葡萄酒發(fā)揮抗氧化活性的一個重要因素。綜上所述，銀杏葡萄酒總酚含量高于對照葡萄酒，且其總酚含量與清除自由基能力呈現(xiàn)出較好的相關性。