HPLC-ELSD法測定食品中五種糖的含量

張玲，薛滿*，李曉芹，張超，張雪婧，張芬

蘇州市食品檢驗檢測中心（蘇州 215000）

糖的含量對食品的品質有極為重要的影響，因此準確測定糖的具體組成及含量對食品加工特性及研究食品的風味特性有極為重要的作用[1]。目前針對食品中糖的測定方法大體有化學法、色譜法[2]。GB 5009.8—2016《食品安全國家標準 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》[3]中指出測定食品中糖的兩種方法，包括蒸發光散射檢測器法和視差折光檢測器法，其中，視差折光檢測器在使用前需平衡時間較長，近2 h，且受外部環境干擾嚴重，靈敏度較蒸發光散射檢測器方法低1～3個數量級，不能用于梯度洗脫系統。另外，通過試驗發現國標方法所采用的流動相條件即乙腈和水，不能使五種組分較好分離，所得峰形也不是很好，且分離時間長達30 min。此次試驗的目的就是建立既準確靈敏又省時的測定食品中果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖的HPLC-ELSD的檢測方法，優化得到的HPLC-ELSD方法真正做到了提高了檢測靈敏度和重復性。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

乳粉、蜂蜜、某品牌茉莉清茶，市售。

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖標準品，純度均大于99%，Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、丙酮均為色譜純；氨水為分析純；水為超純水。

1.2 設備與設備

Waters 2695高效液相色譜儀，廠家沃特世科技（上海）有限公司；ELSD檢測器，廠家沃特世科技（上海）有限公司；電子天平，廠家梅特勒。

1.3 方法

1.3.1 標準品的制備

分別稱取經96±2 ℃干燥2 h的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖各1 g，加水定容至50 mL，按試驗需求配制成使用液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：酰氨柱4.6 mm×250 mm，5 μ m；柱溫：40 ℃；流動相：乙腈+丙酮（0.2%氨水）︰水（0.2%氨水）=75︰25（體積比）；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

檢測器條件：蒸發光檢測器；空氣作載氣，氣體壓力40 psi；漂移管溫度80 ℃；增益100；噴霧器冷卻狀態。

1.3.3 樣品制備

蜂蜜：準確稱取1～2 g混勻后的樣品，加水定容至50 mL，搖勻，用干濾紙過濾，棄去初濾液，后續濾液用0.45 μm微孔濾膜至樣品瓶，供液相色譜分析。

奶粉：準確稱取5～10 g試樣于100 mL具塞離心管中，加入50 mL石油醚，混勻，放氣，振搖2 min，于1 800 r/min離心15 min，去除石油醚后重復以上步驟至去除大部分脂肪。蒸發殘留的石油醚，用玻璃棒將樣品搗碎并轉移至100 mL容量瓶中，用50 mL水分兩次沖洗離心管，洗液并入100 mL容量瓶中，緩慢加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，用水定容至刻度，磁力攪拌或超聲30 min，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液，后續濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾或離心獲取上清液過0.45 μ m微孔濾膜至樣品瓶，供液相色譜分析。

飲料：吸取50.0 mL移入100 mL容量瓶中，緩慢加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，用水定容至刻度，搖勻，靜置30 min，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液，后續濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾或離心獲取上清液過0.45 μ m微孔濾膜至樣品瓶，供液相色譜分析。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

當使用蒸發光散射檢測器測定食品中果糖等五種糖時，GB 5009.8—2016[3]采用的流動相條件是乙腈（70%）和水（30%），但通過試驗發現選擇此配比流動相測得的出峰時間較晚，即五種糖全部出峰近30 min。通過優化試驗條件，將有機相換成乙腈和丙酮（1︰1）并添加0.2%氨水，將水相添加0.2%氨水，能夠得到較好的試驗結果，這是因為丙酮能夠使色譜柱處于較為合適的極性，氨水能夠調節流動相的pH，并能抑制糖類水解，使得峰形更好。在此條件下果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖既有很好的分離，又能將時間較國標方法縮短近70%，即全部出峰時間僅10 min左右，優化后的色譜圖見圖1。

2.2 ESLD條件的選擇

對于蒸發光散射檢測器，要想得到較好的基線穩定的色譜圖，選擇好漂移管溫度和載氣流速是很有必要的，漂移管溫度對檢測器的響應有直接影響，適宜的溫度能夠使其達到較高的信噪比又不至于由溫度過高而引起的組分部分汽化而導致響應值變小的情況。GB 5009.8—2016對檢測器的條件沒有做明確具體規定，試驗經過優化蒸發光散射檢測器條件后得出，漂移管溫度為80 ℃，氣體壓力為40 psi，增益為100，噴霧器冷卻狀態，此時噪聲信號較小，同時色譜圖的基線平穩，更適用于測低濃度目標組分。

2.3 加標回收率試驗

選用某品牌茉莉清茶作待測樣品進行三水平加標試驗，每個水平取6份，并加入一定量的混合標準溶液，按飲料方法進行前處理，測定條件一致并進行6次平行試驗，外標法定量計算回收率，五種糖的回收率均較為理想，方法可靠。標準曲線結果匯總于表1，圖譜見圖1，三水平加標回收率、加標量及相對標準偏差數據匯總于表2～表6，圖譜見圖2～圖5。

表1 標準曲線及R2值

圖1 標準曲線重疊色譜圖

表2 某品牌茉莉清茶中果糖加標回收率及精密度（n=6）

表3 某品牌茉莉清茶中葡萄糖加標回收率及精密度（n=6）

表4 某品牌茉莉清茶中蔗糖加標回收率及精密度（n=6）

表5 某品牌茉莉清茶中麥芽糖加標回收率及精密度（n=6）

表6 某品牌茉莉清茶中乳糖加標回收率及精密度（n=6）

圖2 某品牌茉莉清茶中所含糖的色譜圖

圖3 某品牌茉莉清茶1水平加標回收6平行重疊色譜圖

圖4 某品牌茉莉清茶2水平加標回收6平行重疊色譜圖

圖5 某品牌茉莉清茶3水平加標回收6平行重疊色譜圖

2.4 樣品應用

蜂蜜樣品、可樂樣品和乳粉樣品前處理按1.3.3操作，并上機進行測定，結果見表7，圖譜見圖6～圖8。

表7 樣品測定結果 g/kg

圖6 蜂蜜中所含糖的色譜圖

圖7 奶粉中所含糖的色譜圖

圖8 可樂中所含糖的色譜圖

3 討論與結論

試驗采用HPLC-ELSD法測定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖五種糖，優化并具體化了試驗條件，使用蒸發光散射檢測器，漂移管溫度80 ℃，空氣作載氣，氣體壓力40 psi，色譜柱溫度40℃，進樣體積10 μ L，流速1 mL/min，最終確定流動相為乙腈+丙酮（0.2%氨水）︰水（0.2%氨水）=75︰25（體積比），其檢測速度快，試驗結果重復性良好，線性良好，相關系數均大于0.99，加標回收率在94.7%～110.0%之間，相對標準偏差（n=6）在0.3%～3.0%之間，分析結果可靠。