超臨界二氧化碳萃取核桃青皮多酚及其體內抗氧化性

劉迪，宋曉宇，李婧，尚華，楊建民

1. 陜西工業職業技術學院（咸陽 712000）；2. 陜西海升果業發展股份有限公司（西安 710100）

核桃青皮（Walnut green husk）又稱青龍衣，功效成分多樣，含有萘醌、多酚、多糖等多種有效成分[1-4]，因其具有鎮痛、抗菌、消炎、抗腫瘤等多種功效[5-9]，在中國古代就被入藥使用。

但是，目前大量的核桃青皮資源沒有被綜合利用，而是作為廢料被丟棄。因此，試驗以核桃青皮為分離原料，采用超臨界二氧化碳萃取技術分離核桃青皮多酚，并利用正交試驗優化分離條件，同時考察提取物體內抗氧化活性，為核桃青皮多酚工業化生產提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青皮粉，購于陜西省寶雞市，在50 ℃條件下烘干，粉碎后過0.15 mm孔徑篩，封裝后在0～4 ℃冰箱保存；沒食子酸、福林酚試劑、無水Na2CO3、95%乙醇、抗壞血酸（VC），均為分析純；丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

UV-5300 PC型紫外/可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；AL 204型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；HA 120-40-01超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取公司）。

1.3 試驗動物

清潔級雄性昆明種小鼠（體質量20±2 g，西安交通大學醫學實驗動物中心）。

1.4 方法

1.4.1 標準曲線的制備[10]

配置50 μg/mL沒食子酸標準溶液，準確吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL，分別放入25 mL具塞比色管中，依次加入8.75 mL 20%福林酚試劑、5.00 mL 7.5%碳酸鈉溶液，加水定容。放置40 min后以樣品空白為參比溶液，在760 nm波長處測其吸光度，并繪制標準曲線。

1.4.2 超臨界CO2萃取單因素試驗

選取萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、乙醇體積分數、夾帶劑用量、CO2流量6個單因素作為考察因素。稱取50 g的核桃青皮粉，按一定比例與一定體積分數乙醇攪拌混勻，放入到超臨界萃取釜中，在一定條件下進行萃取。萃取過程中，設定分離壓力10 MPa、分離溫度25 ℃。按照1.3.1的方法，測定提取物多酚含量，平行試驗3次，計算每次試驗提取量（mg多酚/g核桃青皮粉）、提取量平均值和標準差。

R=C×V×1 000/（m×1 000） （1）式中：R為核桃青皮提取量，mg/g；C為提取液中核桃青皮多酚質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為核桃青皮粉質量，g。

1.4.3 超臨界CO2萃取正交試驗[11-15]

選用六因素三水平，應用L18(37)正交表，設計正交試驗，按照1.3.2的方法進行超臨界CO2萃取，優化萃取條件。

1.4.4 動物試驗方法

小鼠被隨機分為對照組、提取物組和VC組，每組30只，分籠飼養。小鼠先在SPF動物房適應3 d。用純水將提取物和VC溶解成0.4 g/mL的水溶液。每組每天用灌胃針灌胃1次，按0.1 mL/10 g體重連續灌胃15 d。

1.4.5 體內抗氧化活性[16-21]

末次灌胃1 h后，分別從每組取10只小鼠，將小鼠置于水深30 cm、水溫25.0±1.0 ℃的水箱中游泳90 min，小鼠用乙醚麻醉后從動脈取血，將血液在4 000 r/min下離心10 min后取血清，用分光光度法按照丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測試盒說明檢測MDA含量、SOD活力和GSH-PX活力。

1.4.6 數據處理

單因素試驗和體外抗氧化性試驗數據以平均數±標準差（mean±SD）表示；正交試驗數據采用正交設計助手3.1軟件處理和分析；數據顯著性分析用t-檢驗法檢驗，p＜0.05表示顯著性差異，p＜0.01表示極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

多酚標準曲線如圖1所示。標準曲線方程為y=0.095 6x+0.026 2，回歸系數R2=0.995 9，可以用于多酚檢測。

2.2 超臨界CO2萃取工藝優化

2.2.1 單因素試驗結果

圖2為萃取溫度單因素試驗結果。萃取溫度30～50℃時，提取量隨著萃取溫度增大而逐漸升高，50 ℃達到最大，高于50 ℃后提取量反而下降。圖3為萃取溫度單因素試驗結果，萃取壓力增大，提取量也隨之增大，但30 MPa以后增幅明顯減少，趨于平緩。

圖1 多酚標準曲線

圖2 萃取溫度單因素試驗

圖3 萃取壓力單因素試驗

圖4 為萃取時間單因素試驗結果，萃取時間增大，提取量也變大，但萃取時間6 h之后提取量增幅趨于平緩。圖5為乙醇體積分數單因素試驗結果，乙醇體積分數小于70%時，提取量隨著乙醇體積分數增大而逐漸升高，70%達到最大，大于70%后提取量反而下降。

圖4 萃取時間單因素試驗結果

圖5 乙醇體積分數單因素試驗結果

圖6 為夾帶劑用量單因素試驗結果，在2～3 mL/g的夾帶劑用量范圍內，用量升高提取量也變大，大于3 mL/g之后提取量反而下降，并趨于平緩。圖7為CO2流量單因素試驗結果，在20～25 kg/h的CO2流量范圍內，流量升高，提取量也變大，但大于25 kg/h之后提取量反而下降，在35 kg/h后趨于平緩。

2.2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗結果設計正交試驗，應用L18(36)正交表，考察萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、乙醇體積分數、夾帶劑用量和CO2流量6個因素對提取量的全面影響。試驗結果如表1所示，方差分析如表2所示。

正交試驗結果表明，各因素對核桃青皮多酚提取量影響順序大小為：萃取溫度＞CO2流量＞乙醇體積分數＞萃取壓力＞夾帶劑用量＞萃取時間。最優萃取條件為：萃取溫度50 ℃、萃取壓力30 MPa、萃取時間6 h、乙醇體積分數75%、夾帶劑用量3 mL/g、CO2流量30 kg/h。此最佳條件在正交試驗中未出現過，所以需要在此條件下進行驗證試驗。通過3次重復試驗，得到的平均提取量為8.83 mg/g。

圖6 夾帶劑用量單因素試驗結果

圖7 CO2流量單因素試驗結果

表1 正交試驗結果及分析

表2 正交試驗結果方差分析表

方差分析結果表明，各因素F值也顯示影響提取量大小順序為：萃取溫度＞CO2流量＞乙醇體積分數＞萃取壓力＞夾帶劑用量＞萃取時間。這與表1分析結果一致，且萃取溫度對提取量影響最顯著（p＜0.05）。

2.3 體內抗氧化活性

2.3.1 MDA含量

如圖8所示，與對照組相比較，核桃青皮多酚提取物和VC均可以減少MDA含量（p＜0.05）。MDA是脂質過氧化反應的產物，脂質過氧化反應過程會產生大量的自由基，對機體造成不同程度的損傷。核桃青皮多酚提取物可以顯著降低機體MDA含量，表明其可以降低機體由脂質自由基引起的損害。

圖8 不同樣品對小鼠MDA含量的影響

2.3.2 SOD活性

如圖9所示，核桃青皮多酚提取物和VC均顯著地增強了SOD活性（p＜0.05）。SOD可以將O2-·還原為H2O2和O2，GSH-PX可將有機過氧化物和H2O2還原為水和無毒物質，因此SOD可以保護機體免受自由基的損傷。核桃青皮多酚提取物可以顯著提高SOD活性，表明其可以通過提高SOD活性提高機體清除自由基的能力。

2.3.3 GSH-PX活性

如圖10所示，VC可以顯著增強GSH-PX活性（p＜0.05），而核桃青皮多酚提取物對GSH-PX活性的影響并不顯著（p＞0.05）。GSH-PX是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，可以清除由活性氧和·OH誘發的脂質過氧化物，保護細胞膜結構和功能的完整性，進而有效防止機體損傷。與對照組相比較，核桃青皮多酚提取物可以提高GSH-PX活性，但效果不是很顯著，表明其通過提高GSH-PX活性從而提高機體保護能力的作用不明顯。

圖9 不同樣品對小鼠SOD活性的影響

圖10 不同產物對小鼠GSH-PX活性的影響

3 結論

結果顯示，超臨界二氧化碳提取核桃青皮多酚最優提取條件為：萃取溫度50 ℃、萃取壓力30 MPa、萃取時間6 h、乙醇體積分數75%、夾帶劑用量3 mL/g、CO2流量30 kg/h。在此最優條件下提取量可以達到8.83 mg/g，各因素對提取量影響順序為：萃取溫度＞CO2流量＞乙醇體積分數＞萃取壓力＞夾帶劑用量＞萃取時間。提取物可以顯著降低小鼠丙二醛（MDA）含量（p＜0.05）、提高超氧化物歧化酶（SOD）活性（p＜0.05），展現較為顯著的體內抗氧化活性。