龍須菜酶解制備瓊膠寡糖的工藝優化

鄧宇峰，林娟，葉秀云，楊捷*

福州大學，福建省海洋酶工程重點實驗室（福州 350116）

龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）是江籬（Gracialaria Greville）屬下的一種海藻類植物，種植面積廣，年產量高。目前龍須菜主要作為制備瓊膠和制作鮑魚飼料的原料[1]。目前瓊膠主要作為生物試驗的培養基、食品凝固劑等，利用價值低。瓊膠經過化學或生物方法處理后可得到各種具有功能活性、低分子量的瓊膠寡糖[2]。新瓊寡糖一般指聚合度2～10的低聚糖，主要由新瓊二糖的重復單位連接而成。天然瓊膠多糖因其黏性大、不易溶解、難消化、分子量大等缺點[3]，難以被人體利用；但瓊膠多糖被降解后生成的新瓊寡糖在有效清除自由基抗氧化[4-5]、抗菌[6]、益菌[7]、抗腫瘤[8-9]、誘導細胞凋亡、預防糖尿病等方面具有顯著的生物活性，可廣泛用于食品、飼料[10-11]、化妝品[12]和醫藥等行業，與當前社會的健康、綠色、安全等理念相呼應，成為國內外學者們的研究熱點[13]。

目前國內外制備瓊膠寡糖的方法分為化學分解法和生物分解法[2]。化學分解法包括強酸分解法、氧化還原分解法、衍生化分解法。其中應用最廣泛的是酸降解法（鹽酸、乙酸、硫酸、檸檬酸等）。鹽酸降解產物主要集中在三糖至八糖，硫酸降解產物集中在一糖至二糖，采用酸降解得到的寡糖得率高，但存在產物不均一，需要高溫酸解、污染環境、寡糖活性喪失，產物分析和回收難等問題，故而難以進行工業化生產功能性寡糖，以滿足社會需求[14]。生物分解法采用瓊膠酶對瓊膠多糖糖苷鍵進行特異性剪切，生成不同分子量的功能性寡糖。生物學方法能夠克服化學方法存在的不足，具有分解條件溫和、易控制、產物專一性好、產物易于分離純化和分析、產物活性高、工藝綠色環保等優點[15]。

試驗選取龍須菜為原料，采用纖維素酶酶解其細胞壁中含量較多的纖維素以便其中的瓊膠釋放出來，再采用瓊膠酶酶解瓊膠制備瓊膠寡糖，以最大化地提高瓊膠寡糖得率。目前國內制備新瓊寡糖的原料為瓊膠[16]，試驗直接選取瓊膠的上游原料作為底物，省去龍須菜高溫水提瓊膠的工藝，簡化寡糖的制備工藝，建立酶解制備最優工藝，并對酶解產物進行高效液相分析，以實現龍須菜的高值化利用，并為功能性瓊膠寡糖的應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍須菜，福建億達食品有限公司，洗凈烘干后備用；瓊膠酶由福州大學海洋酶工程重點實驗室提供，酶活為1 074 U/mL，在pH 5.0～9.0穩定；纖維素酶，福建福大百特科技發展有限公司；苯酚、硫酸、半乳糖、葡萄糖等試劑均為分析純；新瓊寡糖標準品，青島博智生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

T 6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；CF 16 RXII高速冷凍離心機，日本HITACHI公司；MXX-612電子天平，DENVER INSTRUMENT；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；Waters色譜儀，沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水解度測定

取1 mL酶解液，加入0.5 mL 5%苯酚溶液，迅速加入2.5 mL濃硫酸，充分混勻，室溫放置30 min，測定OD490。通過半乳糖標準曲線[17]計算酶解液中的多糖含量。按式（1）進行計算。

式中：n為酶解液中糖含量，mg；m為龍須菜干質量，mg。

1.3.2 還原糖含量測定

準確取1 mL酶解液，然后加入1.5 mL DNS溶液，水浴鍋煮沸5 min，置于冷水中冷卻至室溫。測定OD540，再通過半乳糖標準曲線計算酶解液中的還原糖含量。

1.3.3 瓊膠酶酶解龍須菜的單因素試驗

不同顆粒大小（過40目，40～60目和60目）的龍須菜用相應pH（4，5，6，7和8）緩沖液配成一定濃度（0.3%，0.5%，1.0%，2.0%和3.0%）的底物，加入適量（10，20，25，30和40 U/mL）瓊膠酶液，在一定溫度（30，40，45，50和60 ℃）條件下振蕩反應一定時間（3，5，8，10和16 h），立即沸水滅酶5 min，離心（12 000 r/min，5 min），過濾，蒸餾水定容至一定體積，苯酚-硫酸法測糖含量計算水解度，DNS法測定其還原糖含量。

1.3.4 纖維素酶酶解龍須菜單因素試驗

不同顆粒大小（過40目，40～60目和60目）的龍須菜用相應pH（3，4，5，6和7）緩沖液配成一定濃度（0.3%，0.5%，1.0%，2.0%和3.0%）的底物，加入適量（2，3，5，6.5和8 U/mL）酶液，在一定溫度（30，40，45，50和60 ℃）條件下振蕩反應一定時間（3，5，8，10和16 h），立即沸水滅酶5 min，離心（12 000 r/min，5 min），過濾，蒸餾水定容至一定體積，苯酚-硫酸法測糖含量計算水解度，DNS法測定其還原糖含量。

1.3.5 復合酶解纖維素酶添加量的確定

在pH 6.5，酶解時間為5 h，酶解溫度為45 ℃，底物濃度為1%、瓊膠酶添加量為30 U/mL、龍須菜顆粒大小為40～60目的條件下，研究不同纖維素酶添加量（2，3，5，6.5和8 U/mL）對水解度的影響。

1.3.6 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，利用L9(34)正交表進行試驗設計，運用方差分析試驗結果，確定最優提取工藝。因素水平編碼表如表1所示。

表1 正交試驗設計因素水平編碼表

1.3.7 產物分析

對酶解產物進行高效液相色譜分析，HPLC條件：檢測器為示差檢測器；色譜柱為氨基柱；柱溫為50 ℃；流動相為乙腈-水溶液（體積比為70︰30）；流速為1 mL/min。

2 結果與分析

2.1 瓊膠酶酶解龍須菜單因素試驗

在龍須菜顆粒大小為過40～60目篩、底物濃度0.5%、pH 7、加酶量30 U/mL、酶解時間5 h、酶解溫度45 ℃的條件下，水解度最高為37.8%（圖1）。劉燕研[18]究海洋細菌ZCL對龍須菜發酵產寡糖的影響中，發現龍須菜顆粒大小為40目時糖含量最大，與此次試驗的結果一致。隨著顆粒大小的增大，寡糖含量逐漸變小，可能是因為顆粒過大，瓊膠不易釋放出來，底物與酶不能充分地接觸。酶解溫度和酶解pH直接影響酶促反應速率。不同瓊膠酶具有不同的最適溫度與pH，過高或過低都會影響酶活性，從而影響寡糖得率。梅建鳳等[2]研究發現在酶解pH為7.0時還原糖含量最高，為0.477 mg/mL，其瓊膠酶加酶量為250 U/mL，從經濟效益來看，此次試驗瓊膠酶加酶量僅為30 U/mL即可達到5.092 mg/mL的還原糖含量。劉美英等[19]研究發現在酶解溫度為45 ℃、pH為7.0時的瓊膠還原糖含量最高，為0.6 mg/mL。合適的酶解時間與酶濃度也是影響寡糖得率的重要因素之一。酶解時間和酶濃度過短，反應不完全；時間和酶濃度過長，造成浪費能源。邵錦挺[20]研究得到當酶解時間為2 h、底物濃度為0.2%時，瓊膠還原糖含量最高，為0.148 mg/mL，因為其酶解的底物為瓊脂粉，而此次試驗的底物選取的為龍須菜粉末，酶解初始瓊膠釋放較緩慢，因此所需反應時間較長，但是此次試驗還原糖含量較高。韓莎莎[21]研究發現當瓊膠酶加酶量為4%、酶解溫度為40 ℃、酶解pH為6.0、酶解時間2 h時，其龍須菜多糖的還原糖含量最高，為2.23 mg/mL。侯艷平[22]發現當龍須濃度為2%、瓊膠酶加酶量為2.5 μg/mL時，得到的還原糖質量濃度最高，為2 mg/mL。姚德桓[23]在酶解溫度40 ℃、pH 7.0、加酶量15 U、底物濃度1.1%、酶解時間40 min的條件下，還原糖含量達到最高，為1.762 mg/mL。此次試驗通過優化之后的酶解較為徹底，殘余總糖僅為4.78%，并且還原糖含量較高，為之后瓊膠寡糖的應用奠定基礎。

圖1 不同的酶解因素對瓊膠酶酶解龍須菜水解度的影響

2.2 纖維素酶酶解龍須菜單因素試驗

在龍須菜顆粒大小為過60目篩、底物濃度0.5%、pH 6、加酶量6.5 U/mL、酶解時間5 h、酶解溫度45 ℃的條件下水解度最高，為22.1%（圖2）。萬瑋等[24]研究瓊膠酶降解龍須菜制備寡糖的過程中發現當龍須菜顆粒大小為60目時糖含量最大，這與此次試驗結果一致。譚佩毅等[25]在研究纖維素酶制備殼寡糖的過程中發現當纖維素酶添加量為1.2%、酶解溫度50 ℃時寡糖得率最大。李慶旺[26]以纖維素酶酶解瓊脂糖制備寡糖的過程中得到纖維素酶加酶量1 909.3 U/mL、酶解溫度50 ℃、酶解時間24 h、酶解pH 4.9時的還原糖轉化率最高，為29.58%。

圖2 不同的酶解因素對纖維素酶酶解龍須菜水解度的影響

2.3 復合酶解纖維素酶添加量的確定

在瓊膠酶酶解龍須菜的最優條件基礎上，通過改變纖維素酶加酶量來確定復合酶解的最優添加量。隨著纖維素酶量的增加，龍須菜水解度呈先增大后趨于平穩的趨勢，還原糖含量也有同樣的趨勢；當纖維素酶添加量達6.5 U/mL時，龍須菜水解度最高，達43.9%，還原糖含量達8.8 mg/mL（圖3）。添加纖維素酶可以提高龍須菜的水解度和還原糖含量，可能是纖維素酶通過降解龍須菜細胞壁中的纖維素得到纖維寡糖提高水解度，并且使龍須菜內的瓊膠釋放出來，與瓊膠酶充分接觸酶解。

圖3 纖維素酶加酶量對水解度的影響

2.4 正交試驗設計及結果

方差分析可知，只有因素D（底物濃度）對龍須菜水解度具有顯著性影響，因素作用的主次順序為D（底物濃度）＞A（瓊膠酶加酶量）＞C（pH）＞B（纖維素酶加酶量）。通過表3和表4可知，最優水平組合為A3B3C2D1，即瓊膠酶加酶量為30 U/mL，纖維素酶加酶量為6.5 U/mL，pH為6.5，底物濃度為0.5%，此時龍須菜水解度為56.6%。經過驗證，龍須菜的水解度為57.6%。并對酶解后的龍須菜殘渣進行多糖含量的測定，其中多糖含量僅為3.27%，說明酶解得較為徹底，并且可明顯得出在酶解過程中添加纖維素酶可以提高水解度。

劉剛[27]采用鹽酸酸解龍須菜瓊膠制備瓊膠寡糖，并對酸解條件進行了響應面優化，得到水解率（反應液糖含量/瓊膠總糖含量）為81.43%。徐強等[28]同樣采用鹽酸水解龍須菜瓊膠，在鹽酸濃度0.075 mol/L、水解120 min、底物濃度1%的條件下，水解度為87.2%。而此次試驗采用瓊膠酶與纖維素酶復合酶解龍須菜提取瓊膠寡糖，省去提取瓊膠的步驟，簡化制備工藝，并且得到了高水解度的酶解產物，通過瓊膠酶酶解的水解度可達97.5%，相對于酸法制備瓊膠寡糖來說，其具有分解條件溫和、易控制、產物專一性好、產物易于分離純化和分析、產物活性高、工藝綠色環保等優點，且利用該方法的水解度高。

表2 正交試驗設計及試驗結果

表3 方差分析表L9(34)

2.5 產物分析

對酶解產物進行高效液相色譜分析，在此條件下，新瓊寡糖標準品按照分子量大小的順序出峰，其出峰時間分別為6.44，9.33，13.44和21.94 min。對照標準品，確定酶解24 h產物主要為新瓊四糖（峰值占比為89%），含有少量的新瓊二糖（峰值占比為11%）（圖4）。不同的瓊膠酶的作用機制各不相同，因此其酶解終產物也各不相同。其中侯艷平[22]、姚德桓[23]、唐嘯龍[29]與此次試驗的降解終產物相同，均為新瓊四糖與六糖為主，最后出現新瓊二糖，其中采用的瓊膠酶分別來源于火色桿菌屬、海洋弧菌屬和海洋桿菌屬，均為β-瓊膠酶。而王靜雪[30]、董素潔[31]降解得到的最小單位為新瓊四糖，終產物為新瓊四糖與六糖，無新瓊二糖，所采用的瓊膠酶分別來源于單胞桿菌屬、嗜瓊膠卵鏈菌屬，均為β-瓊膠酶。而此次試驗的瓊膠酶來源于耐熱微球菌，也為β-瓊膠酶，降解終產物為新瓊四糖與新瓊二糖，屬于內切酶。

圖4 瓊膠寡糖HPLC圖

3 結論

采用瓊膠酶與纖維素酶直接酶解龍須菜制備瓊膠寡糖，考察不同因素對酶解過程中水解度和還原糖的影響。在單因素試驗基礎上，通過正交試驗得出最佳酶解工藝：底物濃度0.5%，酶解溫度45 ℃，pH 6.5，瓊膠酶加酶量30 U/mL，纖維素酶加酶量6.5 U/mL，龍須菜顆粒大小為過40～60目篩，酶解時間5 h，得到的水解度為56.6%，還原糖含量為4.652 mg/mL。通過液相色譜分析酶解終產物，主要為新瓊四糖，存在少量的新瓊二糖。此次試驗為功能性瓊膠寡糖的酶解制備和應用打下基礎，后續可對此混合寡糖進行分離純化得到大量高純度的新瓊四糖與少量新瓊二糖。