響應面法優化丹酚酸B提取工藝

趙孟浩，孫國杰*

河北科技大學生命科學與工程學院（石家莊 050018）

丹參是唇形科多年生草本植物。丹參中含有兩類主要成分，一類是脂溶性的丹參酮類，另一類是水溶性的丹酚酸類。丹酚酸類物質中以丹酚酸B為主要成分。通過試驗表明丹酚酸B具有保護心肌，抗肝纖維化的藥理作用，已被廣泛應用于心腦血管等多種疾病的治療[1]。丹酚酸B是目前已知的抗氧化作用最強的天然產物之一[2]。

響應面設計與傳統的均勻設計和正交設計相比，響應面法具有試驗精度高、試驗次數少、數學模型預測性好等優點[3]。對試驗進行全面研究，通過回歸方程分析和圖形分析[4]，得到最佳優化條件。因此，通過響應面法優化丹酚酸B提取工藝，為更加高效提取丹酚酸B提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Waters 1525高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；UPR-11-10 T優普系列超純水器（四川優普超純科技有限公司）；DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；JJ 200型天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；GM-0.33 II隔膜真空泵（天津市金騰實驗設備有限公司）；PL 203電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ 5200 DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

紫花丹參（河北石家莊靈壽縣）；丹酚酸B標準品（含量94.1%，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（Fisher Chemical）；乙腈（Fisher Chemical）；超純水；磷酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 丹酚酸B的提取

將丹參避光陰干，粉碎，過3號篩（篩孔尺寸0.300 mm），精確稱取10 g于250 mL圓底燒瓶中，按照一定液料比、提取溫度和提取時間進行加熱回流提取，提取1次。提取后用濾紙過濾。得到樣品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

將1.3.1小節得到的樣品溶液用水定容至500 mL，過0.22 μm的濾膜，得到供試品溶液。

1.3.3 對照品溶液的制備

精密稱定丹酚酸B對照品適量，加甲醇制備成質量濃度為1.006 mg/mL的對照品溶液。

1.3.4 丹酚酸B的含量測定

1.3.4.1 色譜條件

色譜條件參照藥典[5]。色譜柱：Waters Symmetry C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：乙腈-0.05%磷酸水。梯度洗脫程序：0～15 min，17%～23%乙腈，15～30 min，23%～25%乙腈，30～40 min，25%～90%乙腈。流速1.0 mL/min；檢測波長286 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.4.2 標準曲線的制備

將1.006 mg/mL的標準稀釋成0.503，0.402，0.302和0.201 mg/mL的標準品溶液，進樣20 μL，測定峰面積，以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5 單因素試驗

稱取10 g丹參粉末，其他因素不變情況下，分別考察料液比、提取溫度、提取時間對丹酚酸B的提取量的影響。篩選出各因素的最佳條件。試驗中料液比用丹酚酸B含量為縱坐標，提取溫度和提取時間則采用峰面積做縱坐標。

1.3.6 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇合適的單因素范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計三因素三水平Box-Behnken響應面試驗，并對結果進行分析，因素及水平見表1。

1.3.7 驗證工藝

選取響應面試驗得到的最優提取工藝，平行3組，計算丹酚酸B的質量，以確定丹酚酸B的最優提取工藝。

2 結果與分析

2.1 高效液相圖譜

丹酚酸B標準品和供試品色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 丹酚酸B標準品圖譜

圖2 丹酚酸B供試品圖譜

2.2 提取溫度單因素試驗結果

固定料液比1︰10（g/mL），提取時間60 min，考察提取溫度60，70，80和

90 ℃對丹酚酸B的提取量影響。如圖3所示，縱坐標為待測樣品的峰面積。在80℃時有最大峰面積，即在相同條件下80 ℃提取的丹酚酸B量最多。

2.3 料液比單因素試驗結果

固定提取溫度80 ℃，提取60 min，提取1次，考察料液比1︰8，1︰10，1︰12，1︰15，1︰20，1︰40和1︰80 g/mL。如圖4所示，料液比1︰15 g/mL時有最大值，當水量繼續增加，提取含量呈下降趨勢，到1︰40 g/mL之后，丹酚酸B含量基本不變。

圖3 提取溫度對丹酚酸B提取量的影響

圖4 料液比對丹酚酸B提取量的影響

2.4 提取時間單因素試驗結果

固定料液比1︰10 g/mL，提取溫度80 ℃，考察提取時間20，30，60，90和120 min時的丹酚酸B提取量。如圖5所示，縱坐標為供試品中丹酚酸B的峰面積，提取時間在20和30 min時，丹酚酸B的提取量最大，隨著時間延長，丹酚酸B的提取量呈下降趨勢。隨著時間增加，丹酚酸B在水溶液中開始慢慢降解，這與其他研究得到的丹酚酸B降解理論一致，丹酚酸B的提取不能采用長時間加熱。Y=27.24+1.26A-1.67B+3.62C-0.12AB+0.31AC+0.28BC-1.02A2-0.077B2-3.37C2。R2=0.986 9，R2adj=0.970 0。

圖5 提取時間對丹酚酸B提取量的影響

表2 丹酚酸B提取工藝優化響應面試驗設計及結果

從表3中的方差分析可知，模型p＜0.000 1，說明以響應值（丹酚酸B提取量）建立的回歸模型極顯著。相關系數R2=0.986 9，修正系數R2adj=0.970 0，表明模型的實測值與預測值吻合，失擬項p＞0.05，失擬項不顯著，表明二元多項式對試驗中的擬合較好。A、B、C、C2對試驗結果影響極顯著（p＜0.01），A2、B2對試驗結果影響顯著（p＜0.05）。

表3 模型回歸方程方差分析

2.5 響應面試驗

2.5.1 響應面試驗設計

試驗設計及相應數據見表2。經軟件Design Expert 8.0.5分析，丹酚酸B提取量與料液比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）的二元多項式模型為

2.5.2 響應面圖分析及優化

根據模型繪制出各因素的等高線和響應面，如圖6～圖8所示，兩兩因素繪制的影響面平緩，可知兩兩因素的交互作用不顯著，這與回歸方程分析給出的結果一致。

2.6 驗證工藝

根據軟件Design-Expert 8.0.5預測的丹酚酸B提取最佳工藝為料液比1∶19.04 g/mL，提取時間20 min，提取溫度85.31 ℃。考慮到實際操作，各因素修正為：料液比1∶19 g/mL，提取時間20 min，提取溫度85 ℃，平行3次試驗，得到丹酚酸B提取量為29.12 mg/g與理論值29.57 mg/g接近。經響應面法優化的丹酚酸B提取工藝可行。

圖6 提取時間和料液比對丹酚酸B提取量影響的等高線和響應面

圖7 提取溫度和料液比對丹酚酸B提取量影響的等高線和響應面

圖8 提取溫度和提取時間對丹酚酸B提取量影響的等高線和響應面

3 結論與討論

單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面設計法優化丹酚酸B的提取工藝，結果表明，建立的二元多項回歸方程擬合度好，該工藝穩定可行。在該工藝的試驗過程中發現，提取溫度對于試驗的結果相比較其他因素影響更加明顯。在對溫度進行單因素試驗時發現，較低溫度時丹參提取液很難抽濾，檢測出丹酚酸B含量較低。這與王萍等得到的結果一致[6]。劉佳妮等[7]在試驗中指出，70 ℃之前丹參多糖含量逐漸增加，70 ℃之后開始減少。這可能是在較低溫度下提取物含有大量多糖，使得溶液黏性增大，流動性差，導致丹酚酸B提取不充分。具體原因還需要更多試驗數據來說明。通過該試驗，為丹酚酸B的提取及更好的開發利用丹酚酸B提供試驗數據。