澤蘭脂肪酸及揮發(fā)油提取及氣相色譜-質(zhì)譜分析

劉暢，陳建波，華梅，李珊珊，張磊，孫印石*

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所（長(zhǎng)春 130112）

澤蘭（Eupatorirm odoratum）為唇形科地筍屬植物地瓜兒苗的干燥全草，是一種常用中草藥。主產(chǎn)于黑龍江、遼寧、浙江、湖北等地。味苦、辛、微溫，歸肝、脾，具有活血化瘀、行水消腫之功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、經(jīng)痛、產(chǎn)后淤血腹痛、水腫[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中常用于多種腸胃疾病、各種肝病及并發(fā)癥，肺心病、心腦血管疾病的治療[2]。澤蘭具有很強(qiáng)的保健功效[3]，而且越來(lái)越多的藥理研究證實(shí)了澤蘭在健康方面的的應(yīng)用價(jià)值[4-8]。目前，澤蘭被我國(guó)衛(wèi)計(jì)委列為可用于保健食品的中藥，隨著我國(guó)健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)澤蘭的研究開(kāi)發(fā)越來(lái)越有必要性。

目前對(duì)于澤蘭化學(xué)成分的研究主要集中于對(duì)其地上莖葉的研究。研究人員采用多種方式對(duì)澤蘭的化學(xué)成分進(jìn)行提取分離和鑒定，主要有黃酮類(lèi)[9]、酚酸類(lèi)[9-10]、萜類(lèi)和甾類(lèi)[11]、多糖類(lèi)[12]等。對(duì)于澤蘭中揮發(fā)油的提取和分析研究較多[13-14]，脂肪酸的提取和分析研究偶見(jiàn)報(bào)道[15]，而對(duì)于SFE-CO2萃取方式提取澤蘭的成分，并用于脂肪酸測(cè)定，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道甚少。

試驗(yàn)采用SFE-CO2萃取對(duì)澤蘭進(jìn)行了提取，分析了影響提取效率的因素，經(jīng)過(guò)甲酯化處理后，采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析技術(shù)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分離，確認(rèn)各成分及含量，同時(shí)對(duì)澤蘭中揮發(fā)油的成分進(jìn)行了GC-MS的分析。這些數(shù)據(jù)為澤蘭的品質(zhì)評(píng)價(jià)及進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與方法

1.1 材料與儀器

澤蘭采集于左家試驗(yàn)站；HCl、KOH、甲醇、無(wú)水硫酸鈉、正己烷，均為分析純；37種脂肪酸甲酯混標(biāo)，Sigma-Aldrich。

超臨界CO2萃取儀，Spe-ed SPE-prime，美國(guó)Applied separations有限公司；GC-MS聯(lián)用儀，Angilent 5975-6890 N，美國(guó)Agilent公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，GZX-9140 MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

澤蘭的SFE-CO2萃取：澤蘭經(jīng)過(guò)自然晾干、粉碎后，過(guò)60目篩。取23 g放入SFE-CO2萃取釜中。以壓力（30，35，40，45和50 MPa）、溫度（25，35，45，55和65 ℃）、萃取時(shí)間（0.5，1，2，3和4 h）為變量進(jìn)行SFE-CO2萃取，樣品接入樣品瓶中，N2吹干，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算得率，加入20 mL正己烷溶解，于4 ℃冷藏待用。

脂肪酸測(cè)定樣品制備：準(zhǔn)確吸取5 mL正己烷溶解的澤蘭提取物上清液于具塞試管，加入5 mL氫氧化鉀-甲醇溶液混勻，置于50 ℃水浴加熱回流1 h，取出，冷卻后加入15 mL 5% HCl。取上清液，用正己烷定容至10 mL，為脂肪酸甲酯化的樣品。量取1 mL脂肪酸甲酯化的樣品通過(guò)0.45 μm的濾膜于過(guò)濾樣品瓶中，作為供試品溶液，取1 μL進(jìn)行SFE-CO2萃取物中脂肪酸的GC-MS分析。

揮發(fā)油測(cè)定樣品制備：準(zhǔn)確吸取0.1 mL正己烷溶解的澤蘭提取物上清液，加入9.9 mL正己烷，稀釋100倍，待做GC-MS分析。

量取1 mL揮發(fā)油待測(cè)樣品上清液，通過(guò)0.45 μm的濾膜于樣品瓶中，作為供試品溶液，取1 μL進(jìn)行SFE-CO2萃取物中揮發(fā)性成分的GC-MS分析。

1.2.2 GC-MS條件

脂肪酸分析GC條件：HP-88彈性石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序，初始溫度140 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至200 ℃，以3 ℃/min升至220 ℃，保持26 min；進(jìn)樣量1.0 μL；載氣（He）流量1.0 mL/min；分流比80︰1；溶劑延遲3 min。

揮發(fā)性成分分析GC-條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序，初始55 ℃，保持1 min，以10 ℃/min速率升至180 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min速率升至270 ℃，保持18 min；進(jìn)樣量1 μL；載氣（He）流量1.0 mL/min；分流比10︰1；溶劑延遲3 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子（EI）源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；溶劑延遲時(shí)間5 min；掃描質(zhì)量范圍m/z 50～500。

2 結(jié)果與分析

2.1 SFE-CO2萃取條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)對(duì)SFE-CO2萃取的壓力、溫度和時(shí)間因素進(jìn)行了系統(tǒng)考察，結(jié)果如圖1所示。

當(dāng)萃取溫度和時(shí)間固定時(shí)，隨著壓力的增加，壓力使罐內(nèi)CO2流體密度增加，流體溶解度增大，極性物質(zhì)的溶解能力增強(qiáng)，萃取率也隨之增加，當(dāng)壓力超過(guò)45 MPa后，提取率基本保持平穩(wěn)，因此選擇40 MPa為最佳提取壓力。

當(dāng)萃取壓力和時(shí)間固定時(shí)，隨萃取溫度升高，物料分子熱運(yùn)動(dòng)加速，有利于增加油脂在流體中的溶解度，提高得率。溫度在35～55 ℃之間，提取率變化不大；當(dāng)溫度超過(guò)55 ℃后，提取率有所下降，可能因溫度的升高，CO2密度下降，使流體的溶解能力下降所致。另外，溫度過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致成分的變性、分解。綜合提取率、能耗、成分穩(wěn)定性因素，選擇35 ℃為最優(yōu)提取溫度。

當(dāng)萃取壓力和溫度固定時(shí)，提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但增加的速率逐漸減緩，存在一個(gè)經(jīng)濟(jì)時(shí)間的終點(diǎn)。1.5 h后提取物的得率增長(zhǎng)明顯緩慢，因此提取時(shí)間選擇1.5 h。

確定SFE-CO2提取澤蘭的最優(yōu)條件為：在35 ℃條件下，提取壓力為40 MPa，提取時(shí)間為1.5 h。得到的深綠色油狀物的質(zhì)量為0.571 2 g，萃取率為2.016%。

圖1 SFE-CO2萃取壓力、溫度、時(shí)間對(duì)產(chǎn)品得率的影響

2.2 澤蘭脂肪酸成分GC-MS分析

按上述GC-MS條件對(duì)SFE-CO2提取澤蘭的脂肪酸成分進(jìn)行分析，其總離子流圖如圖2所示。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算其含量，鑒定結(jié)果如表1和表2。澤蘭的SFECO2提取物中共測(cè)出脂肪酸16種，其中飽和脂肪酸11種，含量較高的有棕櫚酸、硬脂酸和二十二酸，其含量分別為100.05，67.42和64.29 μg/g；不飽和脂肪酸5種，其總量占脂肪酸含量的86.3%，其中含量最高的為α-亞麻酸，這與劉娜[11]的研究一致，其次為亞油酸、油酸，其含量分別為1 082.90，824.72和306.70 μg/g。

脂肪酸是人體必要的營(yíng)養(yǎng)成分，其中不飽和脂肪酸對(duì)人體健康意義重大。不飽和脂肪酸中的亞油酸和亞麻酸人體不能合成，必須從外界獲得。α-亞麻酸對(duì)人體健康極其重要，它是構(gòu)成和生物酶的基礎(chǔ)物質(zhì)，對(duì)人體健康起決定性作用。缺乏α-亞麻酸將導(dǎo)致兒童大腦及視網(wǎng)膜發(fā)育遲緩，注意力不能集中，不能有效吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不均衡，直接影響智力發(fā)育，還會(huì)影響視力，導(dǎo)致厭食、肥胖、免疫力底下等30多種癥狀和疾病。然而α-亞麻酸在人體中普遍缺乏，及時(shí)補(bǔ)充α-亞油酸及其重要。亞油酸因其具有降低血液膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化而備受重視。研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇必須與亞油酸結(jié)合后，才能在體內(nèi)進(jìn)行正常的運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝。亞油酸可促進(jìn)膽固醇和膽汁的排出，降低血中膽固醇的含量。試驗(yàn)對(duì)澤蘭的脂肪酸分析結(jié)果顯示，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的86.3%，為極高的比例，特別是相同碳原子數(shù)的油酸、亞油酸和α-亞麻酸含量最高，可能此次試驗(yàn)篩選的SFE-CO2萃取壓力和溫度等條件剛好對(duì)上述幾種不飽和脂肪酸具有較高的萃取效率。

圖2 SFE-CO2萃取澤蘭脂肪酸GC-MS的總離子流圖

表2 SFE-CO2萃取澤蘭脂肪酸成分的種類(lèi)和相對(duì)含量

2.3 澤蘭揮發(fā)性成分GC-MS分析

按上述GC-MS條件對(duì)SPF-CO2提取澤蘭的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，其總離子流圖見(jiàn)圖3。對(duì)圖3中各色譜峰進(jìn)行譜庫(kù)檢索及人工解析質(zhì)譜圖定性，以面積歸一化法測(cè)定其相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。共檢出10種揮發(fā)性化合物，其中揮發(fā)性成分的GC-MS中檢出大量的烴類(lèi)化合物，相對(duì)含量占總質(zhì)量的58.79%，其中含量最高的為甲苯，相對(duì)含量為42.99%；萜類(lèi)化合物4種，相對(duì)含量為36.49%，其中石竹素含量最高，相對(duì)含量為18.72%；醇類(lèi)化合物1種，為植物醇，相對(duì)含量為4.71%。試驗(yàn)檢測(cè)到的揮發(fā)性成分物質(zhì)種類(lèi)比其他檢測(cè)結(jié)果要少[13-14]，此差異可能是由于揮發(fā)性物質(zhì)的提取與檢測(cè)方法不同造成的。

此次試驗(yàn)澤蘭中烴類(lèi)物質(zhì)的含量較高，這與其他研究者的結(jié)果不一致[13-14]。萜類(lèi)是植物揮發(fā)油中的重要組分，澤蘭樣品中檢出7.54%的巴倫西亞橘烯，呈柑橘似香氣；β-石竹烯，具有淡的丁香似香味，有局部麻醉、治療結(jié)腸炎、鎮(zhèn)咳等作用；石竹素，其具有修復(fù)受損性細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞再生、抗炎的功效，是中藥中重要的有效成分之一。醇類(lèi)化合物中的植物醇[14]，其有很弱的花香和香脂香氣，天然存在于茉莉精油和茶葉中，具有抗氧化作用。這些成分可能與澤蘭的“活血調(diào)經(jīng)，祛瘀消癰，利水消腫”功效有關(guān)。

圖3 SFE-CO2萃取澤蘭揮發(fā)性成分GC-MS的總離子流圖

表3 SFE-CO2萃取澤蘭揮發(fā)性成分的GC-MS分析

表4 SFE-CO2萃取澤蘭揮發(fā)性成分的種類(lèi)和相對(duì)含量

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)澤蘭揮發(fā)性成分和脂肪酸的分析，分離和鑒定出16種脂肪酸成分和10種揮發(fā)性成分。此次試驗(yàn)的SFE-CO2萃取條件可能導(dǎo)致了部分不飽和脂肪酸成分的富集，因此不飽和脂肪酸在總脂肪酸中占有較高的含量，為86.3%。檢測(cè)到10種揮發(fā)性成分，其中巴倫西亞橘烯、β-石竹烯、石竹素、植物醇幾種成分具有一定的藥理作用，這可能與澤蘭的藥理功效有關(guān)。澤蘭具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健功效，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究探討澤蘭的功效成分、防病致病機(jī)理等提供參考依據(jù)，同時(shí)為生產(chǎn)出療效確切、有效成分清楚、作用明確、毒副作用小的高品質(zhì)藥品和保健品奠定理論基礎(chǔ)。