核桃分離蛋白的制備及其包埋番茄紅素的工藝

龐志花，郭倩，徐若琳，李赫，劉新旗

北京工商大學，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心（北京 100048）

核桃（Juglans regia L.）別名胡桃、羌果，屬胡桃科胡桃屬植物，是一種兼具高營養價值和高經濟價值的名貴果木。在我國，核桃的培育歷史悠久，分布面積廣泛。據世界糧農組織（FAO）統計，2012年中國核桃年產量占世界年產量的49.73%，達170萬 t，居世界第一[1]。然而目前核桃主要是用于榨油，其副產物餅粕中蛋白質含量達55%，深加工程度太低，大部分用于飼料，產品附加值太低[2]，浪費了寶貴的核桃蛋白資源。

有研究表明核桃蛋白在堿性條件下乳化性和溶解性均較好，而在pH 5.0左右溶解度迅速下降[3]。試驗擬根據這一特征，以pH為關鍵工藝條件，開發以核桃蛋白為壁材的脂溶性活性成分的微膠囊；近些年植物蛋白因其資源充足、功能性好，已經成為備受關注的包埋壁材[4]，但尚未見核桃蛋白作為壁材的相關研究報道。番茄紅素在光照、熱源和氧存在的環境條件下都極不穩定[5]，較大限制了其應用，目前微膠囊研發成為提高番茄紅素穩定性的核心技術[6]。因此，以核桃蛋白作為包埋壁材，包埋番茄紅素，探索其包埋效果，以期為核桃蛋白的應用提出新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃粉（香玲核桃和雞爪棉核桃的混合粉，購自山東東創食品有限公司）；金龍魚大豆油（嘉里食品有限公司）；番茄紅素（油樹脂形式，番茄紅素含量6.4%，中糧屯河股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃分離蛋白的制備及成分分析[7]

1.2.1.1 核桃蛋白的制備

制備核桃脫脂粉，將核桃粉和正己烷以1︰10（g/mL）的比例混合，常溫下置于磁力攪拌器，攪拌3 h，抽濾所得濾渣，和正己烷以1︰5（g/mL）的比例混合，攪拌1 h，所得濾渣放置于通風櫥，揮發有機試劑以得到脫脂粉。將核桃脫脂粉和水按1︰20（g/mL）的比例混合，調整pH 11，并于常溫攪拌2 h后，以10 000 r/min離心25 min，所得上清液調整pH 4.5，在4 ℃靜置1.5 h，離心收集沉淀。調整沉淀pH 7，透析，真空冷凍干燥即得到核桃蛋白粉。分別參照GB 5009.5—2010、GB/T 14772—2008、GB 5009.3—2010和GB 5009.4—2010的方法測定所得核桃蛋白中的蛋白質、脂肪、水分和灰分。

核桃分離蛋白的提取率按式（1）計算。

式中：Y表示提取率，%；m1表示核桃脫脂粉質量，g；m2表示冷凍干燥后核桃分離蛋白質量，g。

1.2.2 核桃蛋白包埋番茄紅素的工藝研究

1.2.2.1 番茄紅素微膠囊的制備工藝[8]

配制4%核桃分離蛋白溶液，調節pH 11，于50 ℃水浴攪拌使核桃分離蛋白充分溶解，加入0.5%單甘酯，即為水相。在避光條件下，將稱取的番茄紅素油樹脂用適量的乙酸乙酯溶解，再加入體積分數為15%的大豆油，均質2 min，即為油相。將油相按照所需比例緩慢加入到水相中，攪拌并均質2 min（9 000 r/min，如無其他說明）。為使得芯壁材料充分接觸，在設定溫度（50 ℃，如無其他說明）包埋反應一定時間（50 min，如無其他說明）。溫度降至室溫，調節體系pH至4.5，離心得沉淀，真空冷凍干燥即得微膠囊粉末。

1.2.2.2 核桃分離蛋白包埋番茄紅素的包埋效率的測定

利用紫外分光光度法，在474 nm處測定吸光度，繪制番茄紅素標準曲線；稱取0.2 g微膠囊于50 mL具塞試管中，直接加入萃取液萃取微膠囊表面番茄紅素，用于測定包埋表量；試管中首先加入適量堿性蛋白酶溶液，調節pH 8，于50 ℃水浴酶解核桃蛋白壁材，加入萃取液萃取番茄紅素，用于測定包埋總量；將有機相定容至50 mL，于474 nm處測定吸光度，并代入標準曲線回歸方程計算番茄紅素含量。微膠囊化的效果評定采用微膠囊化效率和產率2個指標。微膠囊化的效率和產率按式（2）和（3）計算。

1.2.2.3 微膠囊工藝基本參數的確定

根據包埋效率和產率確定最佳芯壁比，分別確定參數。

1.2.2.3.1 芯壁比

固定壁材質量分數4%，芯壁比選取2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和1∶5這6個水平，在不添加任何乳化劑的情況下確定最佳芯壁比。

1.2.2.3.2 乳化劑

選取改性大豆磷脂（HLB=11）、蔗糖酯（HLB=13）、T-80（HLB=15）和水分散型分子蒸餾單甘酯（HLB=11～16）4種乳化劑，在芯壁比1︰2條件下評價包埋效果。

1.2.2.3.3 乳化劑添加量

在芯壁比1︰2條件下，選取0.25%，0.50%和1.00%這3個水平添加選定的乳化劑，評價包埋效果。

1.2.2.4 微膠囊制備的工藝優化

1.2.2.4.1 單因素試驗

采用單因素試驗分別考察均質剪切速率（6 000～16 000 r/min）、包埋溫度（40～80 ℃）、包埋時間（25～70 min）對微膠囊化效果的影響。

1.2.2.4.2 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，利用L9(34)正交表對均質機剪切速率、包埋溫度和包埋時間進行優化，以微膠囊化效率和產率作為考察指標。

1.2.2.5 微膠囊化番茄紅素的穩定性的測定

分別將未包埋和包埋的番茄紅素裝入透光的無色試劑瓶中，封口，在室溫條件下置于LED仿太陽光燈（18 W，佛山市錦昊光電科技有限公司）下照射，照射的垂直高度20 cm；每隔一段時間測定番茄紅素含量。

2 結果與討論

2.1 核桃蛋白基本組成成分分析

試驗得出，核桃分離蛋白提取率為67.54%。核桃粉、核桃脫脂粉和核桃分離蛋白的主要成分見表1。結果顯示，和核桃粉相比，核桃脫脂粉脂肪含量降至3.32%，蛋白質含量為13.51%，其中碳水化合物含量最高，為72.47%。試驗提取的核桃分離蛋白，其蛋白質含量達到86.64%，脂肪含量降至0.53%，碳水化合物含量降至7.36%。

表1 核桃粉、核桃脫脂粉和分離蛋白的主要成分 %

2.2 核桃分離蛋白包埋番茄紅素的工藝確定

2.2.1 芯壁比的選擇

隨著壁材比例升高，包埋效率逐步提高，1︰2時包埋效率達到最高，為44.31%，隨著芯材比例繼續增加，包埋效率下降（圖1）。當芯壁比大于1︰2時，芯材用量增加會導致大量芯材吸附于壁材表面，番茄紅素的微膠囊表量值很高，包埋效率降低；當芯壁比小于1︰2時，核桃分離蛋白濃度太高可能會導致微膠囊液滴較大，導致乳液的不穩定，包埋效果較差[9]。所以芯材或壁材比例過高，均會導致對應所需的壁材或芯材量少，均不利于包埋，導致包埋效率下降。芯壁比對包埋產率也有一定影響，隨著壁材比例的提高，包埋產率呈先下降后趨于穩定的趨勢，這可能是一部分番茄紅素吸附于溶解性較高的核桃分離蛋白，隨離心分離損失導致。

圖1 芯壁比對微膠囊包埋效果的影響

2.2.2 乳化劑種類和添加量的確定

對添加不同乳化劑制得的微膠囊的包埋效率和產率進行測定，結果如圖2（A）所示。添加單甘酯的包埋效果最好，微膠囊化效率和產率分別為59.8%和70.8%。進一步對單甘酯的添加量進行研究，選取0.25%，0.50%和1.00%這3個水平，考察微膠囊包埋效果和產率。從圖2（B）可以看出，單甘酯的添加可大幅提高包埋效率，超過0.5%時，其對包埋效率的影響較小，故選擇0.5%為該乳化劑的最佳使用量。

圖2 乳化劑種類和添加量對微膠囊包埋效果的影響

2.3 微膠囊包埋的工藝條件優化

2.3.1 單因素試驗

2.3.1.1 均質剪切速率

由圖3可知，當剪切速率為9 000 r/min時，包埋效果最好，效率和產率分別為69.4%和81.33%。包埋效率及產率均隨著剪切速率的提高而逐步提高，在9 000 r/min時同時達到最高，此后隨著剪切速率的繼續提高，包埋效率和產率均呈下降趨勢。剪切速率的提高可增強乳液均一性和穩定性，從而提高包埋效果；而當剪切速率超過某一臨界值時，液滴會破乳上浮，發生乳液分層現象，致使包埋效果有所下降。

圖3 剪切速率對微膠囊包埋效果的影響

2.3.1.2 包埋溫度

由圖4可以看出，隨著包埋溫度的升高，包埋效率和產率均提高，在50 ℃時包埋效率和產率均達到最高，分別為67.27%和74.20%。此后隨著包埋溫度的繼續升高，效率和產率均逐漸下降。這是由于溫度較低，核桃分離蛋白和番茄紅素油樹脂的溶解性較差，不利于包埋；隨著溫度的升高，二者的溶解性均有所提高，使得包埋效果提高；當超出最適溫度時，高溫乳液的乳化穩定性變差，不利于包埋而導致效果下降。

圖4 反應溫度對微膠囊包埋效果的影響

2.3.1.3 包埋時間

由圖5可以看出，包埋效率隨著時間的延長而逐步提高，在45～55 min范圍內包埋效率較高，當包埋時間為45 min左右時，包埋效率為69.57%；當包埋時間為50 min時，包埋產率最高，為76.55%。故選定50 min為最佳包埋時間。

圖5 反應時間對微膠囊包埋效果的影響

2.3.2 正交試驗結果

由表2可知，當以包埋效率為指標時，根據極差大小，各因素作用主次順序為剪切速率＞包埋溫度＞包埋時間。由表3可以看出，當置信水平a=0.05，F比（A）＞F0.05，F比（B）＞F0.05時，剪切速率和包埋溫度對包埋效率均有顯著性影響，而包埋時間對效率影響不顯著。綜合直觀分析與方差分析，確定包埋工藝的最優組合：剪切速率9 000 r/min、包埋溫度50 ℃、包埋時間45 min。在此條件下進行試驗驗證，包埋效率為67.94%，對比Li等[9]以類似方法研究的大豆蛋白包埋番茄紅素油樹脂制備的微膠囊，接近其包埋效率69.25%。當以包埋產率為指標時，根據極差大小，各因素作用主次順序為剪切速率＞包埋溫度＞包埋時間（表2）。置信水平a=0.05，FA＞F0.05，說明剪切速率對包埋產率有顯著性影響，包埋溫度和包埋時間對效率影響均不顯著（表3）。綜合直觀分析與方差分析，確定包埋工藝的最優組合為A2B2C3，即剪切速率9 000 r/min、包埋溫度50 ℃、包埋時間50 min。在此條件下進行試驗驗證，包埋產率為80.6%。

表2 番茄紅素微膠囊制備工藝正交試驗表

表3 方差分析表

2.3.3 微膠囊產品的穩定性研究

番茄紅素在光照、熱源和氧存在的環境條件下都極不穩定[4]，其中光照是關鍵因素，較大限制了其應用，試驗初步評價核桃分離蛋白作為壁材包埋番茄紅素對其光照穩定性的影響。圖6所示為光照條件下包埋和未包埋的番茄紅素的保留率隨時間的變化情況。未包埋的番茄紅素在光照下降解速度很快，在10 min內保留率可下降到60%左右，之后降解速率有所減慢，120 min后保留率為46%左右；微膠囊化的番茄紅素，光照穩定性得到很大提高，包埋總量的保留率在10 min后為80%左右，之后降解速率減慢，120 min后保留率維持在70%左右。包埋番茄紅素的降解部分主要是膠囊表面的番茄紅素的降解（表量）。由圖6可以看出，表量的保留率下降速度非常快，60 min后其保留率僅11%左右，而差量，也就是微膠囊內部的番茄紅素在光照時間120 min內保持相對穩定的狀態，降解率不到5%，表明核桃分離蛋白作為壁材對番茄紅素有著很好的保護作用，因此進一步提高包埋效率對于提高番茄紅素的光照穩定性有重要意義。

圖6 包埋前后番茄紅素的光照穩定性

3 結論

此次試驗中，提取核桃中分離蛋白含量達到86.64%，提取率為67.54%。以該蛋白為壁材，以pH為關鍵工藝條件對番茄紅素進行微膠囊化處理，通過對芯壁比、適宜乳化劑及其添加量的研究，進一步通過單因素試驗和正交試驗考察均質剪切速率、包埋溫度和包埋時間對番茄紅素微膠囊效率和產率的影響作用。試驗選定芯壁比1︰2，0.5%單甘脂為適宜乳化劑，試驗優化結果為：芯壁比1︰2、單甘酯添加量0.5%、包埋溫度50 ℃、包埋時間45 min，此時包埋效率最高，為67.94%；芯壁比1︰2、單甘酯添加量0.5%、包埋溫度50 ℃、包埋時間50 min，此時包埋產率最高，為80.6%。同時對包埋后番茄紅素的光照穩定性進行考察，研究證實核桃分離蛋白作為壁材包埋番茄紅素可有效提高番茄紅素的穩定性，尤其是膠囊內部番茄紅素的穩定性，因此提高包埋效率是未來研究重點。