高效液相色譜法分析發(fā)酵肉制品中生物胺

張殿偉，高月宇，王金菊，王艷萍*

1(天津科技大學 食品工程與生物技術(shù)學院，天津,300457) 2(北京工商大學 食品學院，北京,100048)

肉制品是全球消費最普遍的食品，中國肉制品在2017年產(chǎn)量突破1 600萬t，其中，低溫肉制品產(chǎn)量達1 072萬t，占肉制品總產(chǎn)量的64.3%；中高溫肉制品產(chǎn)量達595萬t；占肉制品總產(chǎn)量的35.7%[1]。發(fā)酵肉制品以其獨特的口味和營養(yǎng)價值越來越受到人們青睞，但與發(fā)酵肉制品相關的食品安全問題也很突出[2]，如加工過的肉和發(fā)酵的香腸可能含有對人類有致癌作用的物質(zhì)，并且據(jù)報道會引起結(jié)腸直腸癌[3]。因此發(fā)酵肉制品的質(zhì)量可以通過某些化學危害物質(zhì)如生物胺[4]，在高于最大允許毒理學限度的濃度下進行評估。

生物胺(biogenic amines，BA)是一類含氮的具有生物活性的小分子量有機化合物的總稱，是生物體合成荷爾蒙、核苷酸、蛋白質(zhì)的前體，含蛋白質(zhì)和氨基酸的食品在一定條件下經(jīng)微生物發(fā)酵或者污染較易產(chǎn)生生物胺[5]。生物胺的生理活性主要有生長調(diào)節(jié)(精胺、亞精胺、尸胺)、神經(jīng)傳導(兒茶酚胺、五羥色胺)、炎癥反應的介質(zhì)(組胺、酪胺)[6]。過量攝入生物胺對人體存在潛在危害[7]，生物胺中毒性最大的是組胺，其水平偏高會導致頭痛、高血壓以及消化障礙；毒性次之的酪胺則易引起偏頭痛和高血壓等不適反應；生物胺中的尸胺和腐胺雖然毒性較小，但是能抑制組胺和酪胺代謝酶的活性，從而增加組胺和酪胺的毒性[8-10]。腐胺、尸胺、精胺和亞精胺與氮結(jié)合會產(chǎn)生亞硝酸鹽，并且能反映食品的腐敗程度，它們的存在也會增加酪胺和組胺的毒性[11]。發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中使用的生產(chǎn)菌株或環(huán)境微生物，常因具有氨基酸脫羧酶活性而導致產(chǎn)品中生物胺的積累[12-13]。富含蛋白質(zhì)的發(fā)酵肉制品、魚類、酒類、干酪和豆制品由于易被微生物侵染而可能具有高濃度的生物胺，其中發(fā)酵肉制品是世界上公認的生物胺重要來源[14]。

目前，對發(fā)酵肉制品中生物胺含量的檢測有高效液相色譜法[15-17]、氣相色譜法[18]、離子色譜法[19]、毛細管電泳法[20]等多種方法，這些方法具有檢測靈敏度高、定量分析準確的特點。國內(nèi)外對發(fā)酵肉制品中的生物胺累積已做了大量的研究，認為生物胺在發(fā)酵肉制品中普遍存在，只是不同的發(fā)酵肉制品中存在的種類和數(shù)量不同。

本研究旨在建立高效液相色譜法(HPLC)測定發(fā)酵肉制品中8種生物胺的方法，對市售6種不同類型發(fā)酵肉制品中生物胺的種類和含量進行測定，為控制我國發(fā)酵肉制品中生物胺含量及確保其安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物胺標準品：組胺、酪胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、鹽酸吡哆胺和精胺(純度均>98%)，百靈威科技有限公司；衍生試劑丹磺酰氯(DNS-Cl)，Sigma-Aldrich公司；常用試劑飽和NaHCO3、NaCl、甲酸、正丁醇、乙酸銨、乙腈(色譜純)，天津市天力化學試劑有限公司；其他試劑丙酮(分析純)、三氯甲烷(分析純)、乙醚(分析純),天津市康科德科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AT HPLC儀，日本島津公司；IKA Vortex2渦旋振蕩器，廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；HAC-36C氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；TGL-21M大容量冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；恒溫水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司；Milli-Q超純水器，美國Millipore公司；QUINTIX224-1CN電子分析天平，德國賽多利斯公司；0.22 μm濾膜針頭濾器，頗爾過濾器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液和試劑的配制

準確稱取購買的8種生物胺單體標準品，用0.1 mol/L HCl液配制1 000 μg/mL的標準儲備溶液。分別量取上述儲備溶液，以0.1 mol/L HCl為稀釋液，準確稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1、5、10、25、50 μg/mL的梯度標準溶液，以上所配制溶液于4 ℃冰箱避光儲存。

丹磺酰氯(DNS-Cl)衍生劑：準確稱取1 g丹磺酰氯，加入100 mL丙酮作為溶劑，配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱避光儲存。

1.3.2 樣品的預處理

1.3.2.1 提取

稱取絞碎后的發(fā)酵肉制品樣品5.0 g于50 mL離心管中，分別加入10 mL 0.1 mol/L HCl，5%的三氯乙酸和0.4 mol/L高氯酸溶液并超聲30 min，轉(zhuǎn)移至50 mL具塞離心管中，6 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL容量瓶中，殘渣用20 mL上述溶液再提取1次，合并上清液并稀釋至刻度，待凈化。

1.3.2.2 凈化

除脂肪：移取上述試樣提取液10 mL于25 mL具塞試管中，加入0.5 g NaCl渦旋振蕩至NaCl完全溶解后加入10 mL正己烷，渦旋振蕩5 min，靜置分層后棄去上層有機相，下層試樣溶液加入10 mL正己烷再除脂1次。

萃?。阂迫? mL上述除脂肪后的試樣溶液于10 mL具塞離心管中，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至12.0左右。加入5 mL的正丁醇/三氯甲烷(1+1)混合溶液，渦旋振蕩5 min，5 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層有機相于另一個10 mL具塞離心管中，下層樣液再萃取1次，合并萃取液，用正丁醇/三氯甲烷(1+1)稀釋至刻度。取5 mL萃取液加入200 μL HCl(1 mol/L)，混勻后40 ℃水浴下氮氣吹干，加入1 mL HCl(0.1 mol/L)渦旋振蕩，使殘留物完全溶解，待衍生。

1.3.3 丹磺酰氯(DNS-Cl)衍生方法

在上述待衍生的試樣溶液中依次加入1 mL飽和NaHCO3溶液、100 μL NaOH溶液(1 mol/L)、1 mL丹磺酰氯溶于丙酮(10 mg/mL)渦旋混勻1 min后置于60 ℃恒溫水浴中衍生15 min，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉溶液，振蕩混勻，60 ℃恒溫反應15 min。取出冷卻至室溫，于每個離心管中加入1 mL水，渦旋混合1 min，40 ℃水浴下氮吹除去丙酮(約1 mL)，加入0.5 g NaCl渦旋振蕩至NaCl完全溶解后，加入5 mL乙醚，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，吸出上層有機相(乙醚層)，再萃取1次，合并乙醚萃取液，40 ℃水浴下氮氣吹干。加入1 mL乙腈渦旋振蕩使殘留物完全溶解，0.22 μm濾膜針頭濾器過濾于進樣小瓶，待測定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry C18色譜柱(柱長250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm)，紫外檢測波長254 nm，20 μL的進樣量，柱溫35 ℃，流動相B乙腈與含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液為9∶1(V∶V)，流動相A乙腈與含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液比例為1∶9(V∶V)，流速0.8 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 DNS-Cl法梯度洗脫程序表Table 1 DNS-Cl gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

提取劑種類的選擇與所分析的樣品基質(zhì)特性有關，發(fā)酵肉制品中含有蛋白質(zhì)、脂肪及其他復雜成分，這些成分會影響生物胺的有效成分和定量。對于肉類、水產(chǎn)品及植物性食品中生物胺一般以HCl[21]、高氯酸[22]、三氯乙酸[23]等酸性介質(zhì)提取，故本實驗選取0.1 mol/L的HCl，5%的三氯乙酸和0.4 mol/L高氯酸進行對比，在5.0、10、15 μg/mL三種不同添加水平下對發(fā)酵肉制品中8種生物胺進行提取，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取劑的加標回收率的測定(n=3) Fig.1 Recoveries of different extractions for eight biogenicamines from spiked sample

由圖1結(jié)果表明，使用5%三氯乙酸作為提取劑對8種生物胺的提取回收率顯著性高于0.1 mol/L的HCl和0.4 mol/L高氯酸，其回收率為85.1%～94.3%之間，且RSD小于4.3%。因此選擇三氯乙酸作為發(fā)酵肉制品中8種生物胺的提取劑。

2.2 線性關系與檢出限

采用預處理方法結(jié)合高相液相色譜法對8種生物胺同時進行檢測。本實驗采用外標曲線法進行定量研究，以各標準品峰面積為縱坐標，以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算所得標準曲線的回歸方程以及相關系數(shù)，8種生物胺在0.05～50 μg/mL，該方法具有良好的線性關系，相關系數(shù)R2均大于0.998。進一步以3倍信噪比(S/N=3)作為檢出限的確定標準，以10倍信噪比(S/N=10)作為定量限標準，8種生物胺的檢出限與定量限分別為0.03～0.21 μg/g和0.10～0.69 μg/g，結(jié)果見表2。生物胺標準混合溶液的色譜圖見圖2，發(fā)酵肉制品樣品中生物胺的色譜圖見圖3。由圖3可知，8種生物胺在37 min內(nèi)實現(xiàn)完全分離，彼此之間無重疊。

表2 8種生物胺的線性關系、相關系數(shù)與檢出限Table 2 The regression equtions and correlation coefficient and LOD of 8 biogenic amines

1-色胺；2-β-苯乙胺；3-腐胺；4-尸胺；5-鹽酸吡哆胺；6-組胺；7-酪胺；8-精胺圖2 8種生物胺混合標準溶液的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 8 biogenic amine mixed standards

2.3 發(fā)酵肉制品樣品分析

從當?shù)爻匈徺I6種不同發(fā)酵肉制品為樣品，依照本文所建立的方法對發(fā)酵肉制品樣品進行生物胺含量檢測。檢測結(jié)果見表3。所購買發(fā)酵肉制品中含有8種生物胺，且各生物胺含量均有差異。其中色胺和腐胺在豬肉香腸中含量最高，β-苯乙胺和尸胺在臘肉中含量最高，鹽酸吡哆胺在紅腸中含量最高，組胺和酪胺在臘腸中含量最高，精胺在火腿中含量最高。由測試結(jié)果可以看出，不同發(fā)酵肉制品的生物胺種類和含量不同，這是由于發(fā)酵肉制品生物胺的產(chǎn)生是一個非常復雜的過程，除了與原料肉和所使用的發(fā)酵劑有關之外，還與所采用的工藝條件有關，而臘肉等在發(fā)酵過程中，大量環(huán)境微生物會使發(fā)酵過程具有不確定性和隨意性，導致生物胺的種類和含量也可能會不同。因此，在正常發(fā)酵工藝下要控制每一個環(huán)節(jié)是很困難的，可綜合采用優(yōu)質(zhì)的新鮮原料肉、適當?shù)陌l(fā)酵劑，改變加工、貯藏條件和衛(wèi)生條件來減少食品中生物胺的含量[7]。

a-臘腸；b-豬肉香腸；c-火腿；d-紅腸；e-雞肉香腸；f-臘肉(右圖a1～f1為其對應的局部放大圖) 1-色胺；2-β-苯乙胺；3-腐胺；4-尸胺；5-鹽酸吡哆胺；6-組胺；7-酪胺；8-精胺圖3 8種發(fā)酵肉制品樣品生物胺色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of biogenic amines of fermented meat products

表3 發(fā)酵肉制品中8種生物胺的含量

單位:μg/g

注：-表示未檢出。

2.4 加標回收的測定

向一種發(fā)酵豬肉香腸樣品中分別加入1、5、10 μg/g三種濃度水平的生物胺混合標準溶液。應用本實驗所建立的樣品預處理及高效液相檢測方法進行測定，重復測量3次，其結(jié)果如表4所示。由表4可以得出，8種生物胺加標回收率在83.34%～111.4%，RSD均低于4.85%，表明所建立的方法對8種生物胺的檢測具有較好的準確性和精密度。

3 結(jié)論

本實驗建立了一種快速測定發(fā)酵肉制品中8種生物胺的高效液相色譜法，該方法線性范圍廣，重復性好，準確性高，能夠快速簡便地對發(fā)酵肉制品中的生物胺進行檢測分析，對于發(fā)酵肉制品中生物胺的快速批量檢測有較大的實際應用前景，對我國開展食品中生物胺的風險技術(shù)評估和降低生物胺膳食攝入危險都具有重要參考意義。

表4 8種生物胺的加標回收率的測定Table 4 Recoveries for 8 biogenic amines